高效液相色譜法測(cè)定滴眼液中利巴韋林和諾氟沙星的含量

武曉紅，肖 嫻，趙 輝

（河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開(kāi)封475004）

利巴韋林又名三氮唑核苷（Ribavirin），主要用于①幼兒呼吸道合胞病毒肺炎。②甲型、乙型流感和副流感病毒感染。③流行性出血熱。④單純皰疹。⑤麻疹、腮腺炎、水痘、帶狀皰疹等。利巴韋林滴眼液，適用于單純皰疹病毒性角膜炎。諾氟沙星，氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥，具廣譜抗菌作用，尤其對(duì)需氧革蘭氏陰性桿菌的抗菌活性高。

諾氟沙星為殺菌劑，通過(guò)作用于細(xì)菌DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。諾氟沙星滴眼液主要用于敏感致病菌引起的眼部感染如結(jié)膜炎，角膜炎，沙眼，淚囊炎及眼瞼炎。

紅眼靈滴眼液是河南省人民醫(yī)院眼科研究所研制的一種滴眼液，用于治療“紅眼病”和腺病毒角結(jié)膜炎，有較好的療效，彌補(bǔ)了眼科制劑的不足，為解決患者的病痛提供了更為方便的選擇，該制劑在該院臨床廣泛使用。其處方組成為：利巴韋林（1%），諾氟沙星（0.3%），氯化鈉（0.5%），羥苯乙脂（0.04%）。

文獻(xiàn)［1－2］曾報(bào)道用差示紫外分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定諾氟沙星含量，用紫外分光光度法［3］和高效液相色譜法［4］測(cè)定利巴韋林含量。但是文獻(xiàn)當(dāng)中基本沒(méi)有對(duì)本復(fù)合制劑的含量檢測(cè)方法，而我們建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定紅眼靈滴眼液中利巴韋林和諾氟沙星含量，該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確 ，可為制定紅眼靈滴眼液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀；自動(dòng)進(jìn)樣器；DAD檢測(cè)器；Agilent Chemsstation色譜工作站；甲醇為色譜純；磷酸為分析純。利巴韋林和諾氟沙星對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，紅眼靈滴眼液（規(guī)格：8mL：利巴韋林80mg與諾氟沙星24mg）由河南省眼科研究所制劑室制備。

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil（鉆石）C18柱（250mm×4.6mm，5μm），0.025mol／L磷酸溶液（用三乙胺調(diào)pH 至3.0±0.1）-乙腈（85∶15），流速：1.0mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)：207nm，進(jìn)樣量：20μL。結(jié)果：利巴韋林與諾氟沙星的保留時(shí)間分別為2.70min，10.80min，理論塔板數(shù)分別為3 770，5 360，分離度大于1.5，符合 測(cè)試要求?？瞻讟悠啡芤涸囼?yàn)表明：處方中輔料對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品（A）、陰性樣品（B）、樣品色譜圖（C）1.利巴韋林2.諾氟沙星3.溶劑

1.3 線(xiàn)性范圍

精密稱(chēng)取經(jīng)105℃干燥至恒重的對(duì)照品利巴韋林80mg、諾氟沙星24mg，置100mL量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。精密吸取此溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分別置25mL量瓶中，超純水稀釋至刻度，搖勻。取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各20μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度（g／mL）為橫坐標(biāo)，繪制利巴韋林和諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。回歸方程、相關(guān)系數(shù)（n＝6）分別為：① 利巴韋林：A ＝56.89C＋1.230，r＝0.9998。②諾氟沙星：A＝58.32C＋2.635，r＝0.9997。

結(jié)果表明，利巴韋林在10.0～100.0μg／mL和諾氟沙星在3.0～30.0μg／mL濃度范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

1.4 方法專(zhuān)屬性考察

取樣品各5mL，經(jīng)以下條件處理：①置100℃放置12h；②在光強(qiáng)度為（4000±300）μ條件下放置12h；③加1mol／L氫氧化鈉溶液1mL于100℃放置12h；④加1mol／L鹽酸溶液1mL于100℃放置12h；⑤加l%過(guò)氧化氫溶液1mL于80℃放置12h。然后對(duì)破壞樣品進(jìn)行中和，照樣品含量測(cè)定項(xiàng)下稀釋、濾過(guò)，分別取濾液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明：樣品處理后較處理前有新的雜質(zhì)峰出現(xiàn)，雜質(zhì)含量升高，各雜質(zhì)峰與主要峰分離良好（R＞1.5）。

1.5 最低檢測(cè)限

取線(xiàn)性范圍測(cè)定項(xiàng)下的對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋并進(jìn)樣，按信噪比為3倍計(jì)，作為檢測(cè)限。經(jīng)測(cè)定，本色譜系統(tǒng)條件下利巴韋林和諾氟沙星的最低檢測(cè)限分別為5ng和4ng。

1.6 精密度試驗(yàn)

1.6.1 精密度 同一樣品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄利巴韋林和諾氟沙星色譜峰峰面積，求得利巴韋林和諾氟沙星的RSD分別為0.10%和0.13%（n＝6）。1.6.2 重復(fù)性 取紅眼靈滴眼液樣品，重復(fù)取樣6次，記錄利巴韋林和諾氟沙星色譜峰峰面積，求得利巴韋林和諾氟沙星的RSD 分別為0.57%和0.63%（n＝6）。

1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下的溶液，室溫放置，保持色譜系統(tǒng)穩(wěn)定，于0、1、2、4、8、12h測(cè)定，利巴韋林和諾氟沙星的RSD分別為1.5%和0.67%，說(shuō)明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖2 HPLC方法專(zhuān)屬性考察圖譜A.樣品加熱破壞B.樣品光照被破壞C.堿破壞樣品D.酸破壞樣品E.氧化破壞樣品

1.8 回收率試驗(yàn)

按處方比例分別精密稱(chēng)取利巴韋林和諾氟沙星對(duì)照品，并加入適量輔料配制成含利巴韋林和諾氟沙星80.0%～120.0%的模擬樣品9份，按“樣品含量測(cè)定”項(xiàng)方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果利巴韋林和諾氟沙星平均回收率（n＝9）分別為99.5%和99.7% ，RSD分別為0.70%和0.56%。

1.9 樣品含量測(cè)定

精密量取樣品5mL，置100mL量瓶中，加超純水定容。精密量取上述稀釋液5mL，置50mL量瓶中，加超純水定容，進(jìn)樣20μL，在上述色譜條件下測(cè)定；同時(shí)另取利巴韋林和諾氟沙星對(duì)照品適量，用超純水稀釋成每1mL含利巴韋林50μg和諾氟沙星15μg的溶液作為對(duì)照品溶液，同法測(cè)定；記錄色譜峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果（標(biāo)示量%，n＝3）

2 討論

雖然選擇文獻(xiàn)中流動(dòng)相0.025mol／L磷酸溶液（用三乙胺調(diào)pH至3.0±0.1）-乙腈（87∶13）利巴韋林與諾氟沙星能達(dá)到較好的分離，但諾氟沙星峰有明顯拖尾，并且保留時(shí)間相對(duì)較晚，而將0.025mol／L磷酸溶液（用三乙胺調(diào)pH至3.0±0.1）-乙腈比例改為85∶15，雖改為87∶13后諾氟沙星保留時(shí)間大大提前但是相對(duì)受乙腈的影響也越大故最后選擇85∶15，此比例下的流動(dòng)相有效地改變了諾氟沙星的色譜行為，保留時(shí)間明顯縮短，柱效明顯提高。

由于諾氟沙星在水中微溶，在酸中極易溶解，所以在配制對(duì)照品溶液時(shí)先加入1.0mol／L鹽酸溶液2mL使諾氟沙星溶解后，再用超純水進(jìn)行稀釋。

［1］姜玲.差示紫外分光光度發(fā)測(cè)定諾氟沙星滴眼液的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2004，9（2）：112.

［2］王中蘭，陳菊，馮碧敏.HPLC測(cè)定諾氟沙星滴眼液的含量［J］.哈爾濱醫(yī)藥，2006，26（1）：102.

［3］唐志立，彭賢東，陳建勛等.紫外分光光度法測(cè)定利巴韋林注射液的含量［J］.四川醫(yī)學(xué)，2001，12（12）：3－4.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：260.

［5］敬永生，胡海廷，徐曉燕.高效液相色譜法測(cè)定鹽酸川芎注射液的含量［J］.河南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，28（1）：47－48.