小型豬肝硬化模型肝臟病理及生化指標(biāo)的變化

廖錦元，黃仲奎，黎寧欽，李佳梅

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1放射科;2肝移植科，南寧 530021)

本實驗參考山西肝病研究所的方法［1］，選擇了改良后的四氯化碳(CCL4)、苯巴比妥、無水乙醇 +高脂、低蛋白、低膽堿食物復(fù)合因素造模法喂養(yǎng)小型豬制備肝硬化實驗?zāi)Ｐ?，分析肝纖維化-肝硬化變化過程中病理學(xué)及肝臟生化指標(biāo)的變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

同種系巴馬小型豬50頭(隨機分為實驗組40頭，對照組10頭)，雌雄不限，4月齡，體重15～20 kg，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供(許可證號SCXK桂2010-003)，實驗前抽取耳背靜脈血測量肝功能正常。

1.2 動物模型的建立

實驗組的喂養(yǎng):將65%的玉米面加35%的膽固醇混合組成飼料，先將 CCL4(0.2～0.3 mL/kg/d)、苯巴比妥鈉(2 mg/kg/d)混入少量飼料中快速吃完，然后給予不含 CCL4和苯巴比妥鈉的飼料，并給稀釋成10%的無水乙醇作為唯一飲料，每日喂養(yǎng)1次，喂養(yǎng)24周直至形成肝硬化為止。對照組的喂養(yǎng):給予65%的玉米面加35%的米糠作為飼料，清水作為唯一飲料，與實驗組同期喂養(yǎng)。

1.3 病理組織學(xué)檢查和肝臟生化指標(biāo)檢查

實驗動物予以編號，每一例實驗動物于造模的0、4、8、12、16、20、24 周末進行數(shù)據(jù)采集。

1.3.1 麻醉:動物術(shù)前12 h禁食、水，術(shù)前每頭豬給予氯氨酮10～15 mg/kg+安定1～1.5 mg/kg+阿托品0.02 mg/kg耳后肌內(nèi)注射基礎(chǔ)麻醉。

1.3.2 抽血:開通耳背靜脈，用肝素保留靜脈通道，防止血液凝固，每頭豬分別抽取血液5～10 mL，采出的血液放入干燥采血管。

1.3.3 病理學(xué)分析:18 G活檢針經(jīng)皮肝穿取肝左、右葉肝臟兩份組織，大小約1 cm×0.2 cm，在10%甲醛溶液中固定24～48 h后取材，經(jīng)石蠟包埋、常規(guī)切片后行蘇木素-伊紅染色(HE染色)和膠原纖維染色(Masson染色)，顯微鏡下取40放大倍數(shù)觀察。術(shù)后予80萬單位青霉素預(yù)防感染，繼續(xù)喂養(yǎng)。肝纖維化分級參照西安傳染病會議所訂標(biāo)準(zhǔn)［3］，根據(jù)纖維組織增生情況，將肝纖維化分為 S0、S1、S2、S3、S4五期，以及肝硬化。

1.3.4 生化指標(biāo)的檢測:采集的血液標(biāo)本30 min內(nèi)放入普通常溫高速離心機離心，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，時間為10 min。離心后用移液器取上清液1 mL放入1.5 mL的 Ep管，貼上標(biāo)簽;放入－80℃冰箱中，待實驗全部結(jié)束后一次性解凍，分別檢測總膽紅素(T．BIL)，白蛋白(Alb)，球蛋白(Glb)，A/G比值，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，血清肌酐(Cr)，凝血酶原時間(PT)。

1.4 實驗數(shù)據(jù)分組

設(shè)正常對照組(S0期)，輕度肝纖維化組(S1+S2期)，重度肝纖維化/早期肝硬化組(S3+S4期)，以及肝硬化組。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。分別對實驗組和對照組以及實驗組各組間數(shù)值進行統(tǒng)計學(xué)分析。所得結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組均數(shù)的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，多組均數(shù)的比較采用單析因方差分析(One-Way ANOVA)，方差不齊時應(yīng)用非參數(shù)秩和檢驗(Kruskal-Wallis檢驗)P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 造模一般情況

對照組10頭無1例死亡。實驗組40頭豬24周末共死亡16頭，24頭存活;其中4周末因術(shù)中麻醉意外死亡1頭;8周末因腹瀉感染死亡3頭;12周末因術(shù)中誤傷膽管，衰竭死亡2頭;16周末因術(shù)中麻醉意外死亡1頭，衰竭死亡2頭;20周末衰竭死亡3頭;24周末衰竭死亡4頭。24周末對照組造模存活率為100%(10/10)，實驗組造模存活率為60%(24/40)。

2.2 病理結(jié)果

2.2.1 一般情況:對照組0～24周肝臟組織病理表現(xiàn)正常。實驗組0～24周末肝臟的組織病理學(xué)變化及小型豬造模死亡數(shù)如表1。

24周末，正常對照組獲得數(shù)據(jù) S0期70例次;實驗組獲得數(shù)據(jù)S0期47例次，輕度肝纖維化(S1+S2期)82例次，重度肝纖維化(S3+S4期)62例次，肝硬化共39例次。

表1 實驗組0～24周末病理變化及存活率(單位:例)。Tab．1 Pathological changes and survival of the mini-pigs at 0 ～24thweekend(cases)．

表2肝硬化形成各個階段生化指標(biāo)的變化)。Tab．2Changes of biochemical indexes at different stages of liver fibrosis)．

表2肝硬化形成各個階段生化指標(biāo)的變化)。Tab．2Changes of biochemical indexes at different stages of liver fibrosis)．

注:One-way ANOVA 分析 LSD 法比較，T．BIL、ALB、GLO、A/G、Cr、PT各組間均有統(tǒng)計學(xué)差異，P ＜0.01。AST S0與 S1期沒有差異，P ＞0.05，與S2～S4期均有差異，P＜0.01。ALT各組間均有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01。Note:One-way ANOVA analyses LSD method showed statistically significant difference of T．BIL，ALB，GLO，A/G，Cr，PT in the groups，P ＜0.01，failed to show significant difference of AST in stage S0 and S1，P ＞0.05，however，there was a significant difference in stages S2 to S4，P ＜0.01．There was a significant difference of ALT between different stages，P ＜0.01．

組別Groups總膽紅素 T．BIL(Umol/l)白蛋白ALB(g/L)球蛋白GLO(g/L)A/G 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT(U/L)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST(U/L)血清肌酐Cr(μmol/L)凝血酶原時間PT(s)0 30.9 ±11．9 37.96 ±3．96 19.74 ±9．12 1.12 ±0.05 42.00 ±19.16 27.26 ±9．51 80.10 ±16．23 13.21 ±3＜0.01.43 S1+2 35.6 ±7．9 32.57 ±10．92 28.64 ±7．01 0.97 ±0.13 67.56 ±25.74 92.51 ±13．69 85.93 ±14．07 13.53 ±3.67 S3+4 42.7 ±14．8 27.47 ±4．45 42.71 ±13．3 0.76 ±0.35 113.56 ±26.43 196.18 ±78．2 96.59 ±21．32 17.3 ±4.79 Cirrhosis 52.2 ±17．6 22.73 ±4．05 53.47 ±5．06 0.47 ±0.17 131.56 ±35.57 380.18 ±153．7 101.31 ±23．47 22.79 ±9.16 F 8.666 8.501 35.318 8.354 21.999 26.328 19.21 11.36 P P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P

2.2.2 不同級別肝組織的病理分級:S0級 肝小葉結(jié)構(gòu)呈六面形，匯管區(qū)清楚，肝竇呈輻輪狀分布，肝細(xì)胞呈多面形，核呈卵圓形，核膜清楚(圖1、2);S1級肝小葉中央血管擴張充血，周圍的肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞有點狀壞死，匯管區(qū)輕度纖維結(jié)蒂組織增生伴少量淋巴、單核細(xì)胞浸潤(圖3、4);S2級肝細(xì)胞脂肪變性，肝小葉近中央靜脈處肝細(xì)胞中-重度水變性，氣球樣變，灶狀壞死，匯管區(qū)纖維組織增生，小葉結(jié)構(gòu)存在(圖5、6);S3級 肝細(xì)胞融合壞死，匯管區(qū)見較多的纖維間隔，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無假小葉形成(圖7、8);S4級肝細(xì)胞橋接壞死，肝細(xì)胞團呈不同程度的再生，大小不一的假小葉形成，小葉周邊纖維間隔寬大疏松。有少量淋巴、單核細(xì)胞浸潤(圖9、10);肝硬化假小葉形成，纖維間隔包繞在假小葉周圍，間隔內(nèi)膠原纖維環(huán)繞假小葉周圍呈平行排列(圖11、12)(圖1～12見文后彩插3～4)。

2.3 正常組和實驗組生化指標(biāo)的變化

從正常組到肝硬化組丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、血清肌酐及球蛋白呈逐漸升高的趨勢，而白蛋白，A/G比值呈逐漸下降的趨勢，凝血酶原時間則逐漸延長。詳見表2。

3 討論

肝纖維化、肝硬化動物模型的建立已有相關(guān)的文獻(xiàn)報道，所采用的動物多為大鼠、兔等［2－4，5］，而與人類更為接近的大型動物的肝硬化模型文獻(xiàn)報道較少。本實驗采用巴馬小型豬進行研究有許多優(yōu)點:(1)豬的心血管系統(tǒng)的解剖結(jié)構(gòu)、消化系統(tǒng)、營養(yǎng)需要、骨骼發(fā)育以及礦物質(zhì)代謝與人類十分相似，豬的臟器重量也近似于人。(2)巴馬小型豬生長緩慢，性情溫順，且4個月齡左右豬的生理特點最接近人［6，7］。(3)豬的體重、體積明顯大于大鼠、兔子，有利于手術(shù)操作。(4)豬的體積大小和馴服習(xí)性允許進行反復(fù)采樣、進行各種外科手術(shù)，易于管理。故為臨床上經(jīng)常采用的實驗動物［7－9］。本研究采用巴馬小型豬建立起肝硬化模型，動態(tài)觀察實驗過程中肝組織的病理變化，以期深入的研究肝硬化的病理學(xué)、生化指標(biāo)的變化。

3.1 小型豬肝硬化模型的制備

CCL4中毒性肝硬化化動物模型是一種經(jīng)典的肝硬化造模方法［2，10，11］，其機理主要是 CCL4能溶解肝細(xì)胞膜上的脂質(zhì)成分，同時也影響肝細(xì)胞的細(xì)胞色素P450依賴型混合功能氧化酶的代謝，生成三氯甲基自由基和氯甲基自由基，啟動脂質(zhì)的過氧化作用，致肝細(xì)胞損傷、變性、壞死，長期反復(fù)刺激可造成肝纖維化、肝硬化的形成。苯巴比妥和無水乙醇均能誘導(dǎo)P450的活性從而增加CCL4的肝毒性，加速肝細(xì)胞的變性和壞死，而高脂、低蛋白、低膽堿物質(zhì)則加重肝細(xì)胞的負(fù)荷，從而使得肝硬化形成的時間更短［2，4］。多種藥物聯(lián)合應(yīng)用的復(fù)合因素造模法較單因素造模法優(yōu)良，一方面藥物的聯(lián)合作用可以使得造模時間縮短，另一方面也減少各種藥物的使用劑量以降低藥物的不良反應(yīng)和動物的不耐受性。

大鼠、家兔等小型動物的制模方法通常有腹腔注射、皮下或肌肉注射給藥，豬的個體較大，依從性差，本組實驗采用改良的混合飼料喂養(yǎng)法，實驗組在16～24周末成功制備出肝硬化模型。

3.2 巴馬小型豬肝硬化模型病理及生化指標(biāo)的變化

本研究采用改良的CCL4復(fù)合因素造模法制備小型豬肝硬化模型，在投藥后的第4周末，實驗組已有部分病例的肝臟發(fā)生明顯的病理變化，肝功能也開始出現(xiàn)異常。隨著實驗時間的延長，到24周末，實驗組的肝臟病理從正常的肝纖維化S0期逐漸進展至肝硬化。肝功能的指標(biāo)ALT、AST及TBIL也發(fā)生了變化，表現(xiàn)為S1～S4期、實驗組與正常組對比呈逐漸逐漸升高的趨勢，為肝細(xì)胞中毒的表現(xiàn);肝臟是制造ALB的唯一場所，動物染毒后經(jīng)歷肝細(xì)胞壞死、增生、進而發(fā)生肝纖維化、肝硬化，肝功能持續(xù)受損，ALB表現(xiàn)為進行性降低，引起 A/G倒置。隨著肝纖維化-肝硬化病程的進展，肝硬化性腎性損害以及肝臟的合成、儲備、獲得性凝血因子缺乏，腎小球的濾過率減低，血肌酐升高及PT延長。上述病理生化指標(biāo)的變化，各組間有統(tǒng)計學(xué)差異 P＜0.01，在不同的時間段表現(xiàn)出明顯的階段性特點。

有學(xué)者對國內(nèi)幾種常用的實驗用小型豬的正常生化指標(biāo)進行了對比研究，認(rèn)為實驗用巴馬小型豬的正常生化指標(biāo)與人類的近似［12，13］。本研究組中的正常對照組 T．BIL 為 30.9 ±11.9 μmol/L，ALB為37.96±3.96 g/L，ALT為 42.00±19.16 U/L，AST為27.26±9.51 U/L，PT為 13.21±3.43 s，與王愛德等［13］報道的巴馬小型豬生化指標(biāo)正常值近似。說明本研究組生化指標(biāo)具有較好的可比性。

3.3 小型豬的制模時間與造模存活率

文獻(xiàn)報道［2－4，5］動物的肝纖維化-肝硬化模型成模的時間長短不一，這與不同的方法所采用的實驗動物以及制模方法不同有關(guān)。本組實驗12周末5例出現(xiàn)早期肝硬化，16周末7例出現(xiàn)肝硬化，這與龐榮清等［14］采用獼猴進行肝纖維化造模出現(xiàn)的時間近似，大型動物耐受性較強，造模所需的時間較小型動物也較長。本組實驗造模至24周末，早期肝纖維化進一步發(fā)展形成了不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化，此時纖維膠原包繞假小葉更為緊密，匯管區(qū)炎癥幾乎停止，這與臨床病理反應(yīng)過程表現(xiàn)一致。

隨制模時間的延長，實驗組小型豬死亡數(shù)也逐漸增加，這其中有手術(shù)意外致死3頭，感染腹瀉死亡3頭，其余10頭均為衰竭死亡。這一方面與造模晚期肝功能衰竭，抵抗力下降有關(guān)，另一方面也與多次手術(shù)操作，重復(fù)打擊有關(guān)。本研究實驗組24周末造模存活率 60%(24/40)，與文獻(xiàn)報道相近［15，16］。

［1］ 韓德五，馬學(xué)慧，趙元昌．肝硬化動物模型的研究［J］．山西醫(yī)藥雜志，1979，4:1－6．

［2］ 馬學(xué)慧．肝纖維化動物模型的造作方法［J］．中華肝臟病雜志，1996，4(1):58．

［3］ 中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會．病毒性肝炎防治方案［J］．中華傳染病雜志，2001，19(1):56－62．

［4］ 王麗春，趙連三．肝纖維化的實驗動物模型［J］．中國實驗動物學(xué)報，2004，12(4):246－250．

［5］ Sherlock S．Progress report:hepatic reaction to drugs［J］．Gut 1999，20(4):634－642．

［6］ 劉昌，呂毅，史源，等．巴馬豬肝臟及其附屬管道解剖學(xué)研究與異種移植設(shè)想［J］．動物醫(yī)學(xué)進展，2004，25(1):70－71．

［7］ 詹純列，徐本法，白朝暉．小型豬在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用［J］．中國實驗動物學(xué)雜志，2000，10(2):118－120．

［8］ 李堯清，楊小玲，田英，等．外科動物實驗中豬的麻醉問題［J］．四川動物，2000，19(4):258－259．

［9］ Gran D，Wall W，Mimeault R，et al．Successful intestinal transplantation in pigs treated with cyclosporine［J］．Transplantation，1988，45(3):279．

［10］ Jiang Z，You DY，Chen XC，et al．Monitoring of serum markers offibrosis during CCl4-induced liver damage—effects of antifibrotic agents［J］．J Hepatol，1992，16(3):282 － 284．

［11］ 郭秋，任克．四氯化碳復(fù)合法誘導(dǎo)家兔肝纖維化模型的建立［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，21(3):36－38．

［12］ 劉江偉，張永久，李澤信，等．長白豬仔血常規(guī)及生化指標(biāo)正常值探討［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(7):393－396．

［13］ 王愛德，郭亞芬，立柏，等．巴馬小型豬血液生理指標(biāo)［J］．上海實驗動物科學(xué)，2001，21(2):75－78．

［14］ 龐榮清，劉建昆，何占龍，等．獼猴肝纖維化模型的建立與評價［J］．世界華人消化雜志，2005，13(16):1956－1958．

［15］ 周忠信，王捷，羅葆明．小型豬肝硬化模型建立過程中肝臟功能及組織病理學(xué)的改變［J］．上海實驗動物科學(xué)，2002，22(6):102－105．

［16］ Mclean E，Mclean AEM，Sutton PM．Instant cirrhosis，an improved method for producing cirrhosis in rats by simultaneous administration of carbon tetrachloride and phenobarbitone［J］．Br J Exp Pathol，1996，50(3):502 －510．