小鼠腦部SIRT1與IR受體的共定位

劉 羽，劉 翠，梁 良，黃 瀾，朱 華，盛樹力，秦 川

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

胰島素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用，其主要是通過胰島素酪氨酸激酶受體-胰島素受體底物1(IRS-1)-磷酸肌醇3激酶(PI3K)-AKT信號通路級聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)生理調(diào)節(jié)功能［1］。胰島素受體主要分布在嗅球、海馬、皮層、下丘腦等腦區(qū)［2］，參與很多腦部的生理功能，如調(diào)節(jié)能量代謝、攝食、體重、繁殖、學(xué)習(xí)與記憶力等［3］。

近年來的研究顯示，表觀遺傳學(xué)對學(xué)習(xí)和記憶力過程具有重要的調(diào)控作用［4］。組蛋白去乙?；?sirtuins)屬于蛋白家族，在從細(xì)菌到人類的進(jìn)化過程中起著多效性作用。最早發(fā)現(xiàn)啤酒酵母中的Sir2是第一個人們所認(rèn)知的NAD+依賴的組蛋白去乙?；福?］。組蛋白去乙?；?1(SIRT1)是sirtuins家族中的成員，與Sir2具有高度同源性。除了調(diào)節(jié)組蛋白乙?；臓顟B(tài)以外，SIRT1可以通過調(diào)節(jié)一些轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子在各種生理過程中起到調(diào)節(jié)作用［6］，如參與能量代謝過程、突觸可塑性等。最近研究顯示，SIRT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理和疾病過程中起著重要作用［7］，但具體的分子機制尚未明確。此外，SIRT1還參與糖原代謝過程和調(diào)節(jié)胰島素分泌，當(dāng)小鼠體內(nèi)分泌胰島素的β細(xì)胞受到葡萄糖刺激時，SIRT1可以通過上調(diào)胰島素的分泌從而改善體內(nèi)葡萄糖耐受水平。目前，尚無有關(guān)SIRT1與IR是否存在相互作用的報道，因此在成年小鼠腦組織中研究二者是否存在共定位，為進(jìn)一步研究SIRT1在腦組織中的生理及病理作用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng):SH-SY5Y細(xì)胞株培養(yǎng)條件為:MEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、15 mmol/L 4-HEPES、青霉素 100 IU/mL、鏈霉素 100 IU/mL，于37℃、5%CO2中培養(yǎng)，每周換液2次，傳代1次。

1.1.2 實驗動物:4月齡健康的C57BL/6小鼠4只購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號為［SCXK(京)2009-0007］。動物飼養(yǎng)于恒溫為25℃，具有獨立通風(fēng)系統(tǒng)的動物房，光照12 h，黑暗12 h，自由飲水取食。動物使用許可證編號:［SYXK(京)2011-0022］

1.1.3 實驗試劑:小鼠抗小鼠SIRT1單克隆抗體和MAP2單克隆抗體購自 Abcam有限公司，噻唑藍(lán)(MTT)和PI3K抑制劑LY294002購自Sigma有限公司，兔抗小鼠IRα多克隆抗體購自Millipore有限公司。異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、羅丹明(TRITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG、含有DAPI的水溶性封片劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 組織制備:雄性4月齡的C57BL/6J小鼠采用安樂死并迅速取出腦組織。用OCT復(fù)合物包埋腦組織，采用冠狀面的方向進(jìn)行切片，切片厚度為10 μm。切片在含有4%的多聚甲醛溶液中固定20 min，0.01 mol/L 的 PBS浸泡 30 min，100% 酒精浸泡2 min。固定好的腦組織切片可以放入 －20℃冰箱中保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 噻唑藍(lán)(MTT)代謝率測定細(xì)胞活性:每孔加 MTT(5 mg/mL)20μL，37℃ 孵育 4 h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 mL，振搖10 min后用酶標(biāo)儀(Diagnostic Pasteur LP400)測定550 nm處光密度值(A)。

1.2.2 Western blotting:SH-SY5Y細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，選定胰島素100 nmol/L作用12 h，及加入胰島素信號PI3K抑制劑LY294002濃度為20 μmol/L作用2 h后加入胰島素檢測胰島素信號通路對SIRT1的調(diào)節(jié)作用。將l×104/mL SH-SY5Y細(xì)胞接種于75 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞80%匯合后，更換為無血清MEM培養(yǎng)基，分為空白對照組、100 nM/L胰島素組、LY294002組、LY294002加胰島素組。于12 h后提取細(xì)胞蛋白，以 GAPDH為內(nèi)參照，用Bandscan軟件分析條帶灰度。

1.2.3 免疫組化染色:SIRT1的組化染色按照試劑盒說明步驟進(jìn)行，SIRT1一抗稀釋比例為1∶200。圖像拍照及分子應(yīng)用ProgRes CCD攝像頭及分析軟件。

1.2.4 免疫熒光雙標(biāo)染色:冰凍切片經(jīng)0.5%Triton X-100作用15 min后，接下來經(jīng)8%山羊血清室溫封閉30 min，直接滴加稀釋好的兩個不同來源的一抗，SIRT1、IRα 的稀釋比例分別為 1∶200、1∶100，4℃過夜。次日用0.01 mol/L PBS清洗后加入混合稀釋的熒光標(biāo)記二抗，稀釋比例為1∶200，37℃水浴箱內(nèi)孵育40 min后，0.01 mol/L PBS充分洗滌后用含有DAPI的水溶性封片劑封片。用激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(Leica TCS-SP5)對熒光染色切片進(jìn)行拍照及分析。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法:所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT1在小鼠腦組織中分布

應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測4月齡C57小鼠腦組織中組蛋白去乙酰化酶1(SIRT1)分布，結(jié)果顯示SIRT1在腦組織中分布廣泛，分布于:皮層、海馬、下丘腦、杏仁核等部位(圖1，見封二)，提示其與腦組織的發(fā)育、結(jié)構(gòu)和功能存在一定聯(lián)系。

2.2 SIRT1表達(dá)于神經(jīng)元中

微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)是一種神經(jīng)元標(biāo)記物，由 FITC綠色熒光基團(tuán)標(biāo)記以胞漿著色為主，海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞可見綠色熒光基團(tuán)。同時，在海馬CA1椎體細(xì)胞層的神經(jīng)元胞核均有SIRT1的表達(dá)，為紅色。拍照后的圖像疊加處理發(fā)現(xiàn)，SIRT1主要在神經(jīng)元中表達(dá)(圖2，見封二)。

2.3 SIRT1與IRα的共表達(dá)

IRα為包膜蛋白，F(xiàn)ITC綠色熒光基團(tuán)標(biāo)記的陽性神經(jīng)元主要以包膜著色為主，胞質(zhì)淡染。陽性染色神經(jīng)元主要分布在皮層、海馬、下丘腦區(qū)域(圖3，見封二)。拍照后的圖片疊加處理后發(fā)現(xiàn)，IRα染色陽性(綠色)的皮層區(qū)域、海馬CA1區(qū)及下丘腦區(qū)的神經(jīng)元胞核均有SIRT1表達(dá)(紅色)。DAPI復(fù)染細(xì)胞核形成的藍(lán)色區(qū)域與紅色區(qū)域重疊證實SIRT1表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)。

2.4 胰島素改善SH-SY5Y細(xì)胞系的活性

檢測不同濃度的胰島素(1、10、100、200 nmol/L)12 h后對細(xì)胞活性的影響。如圖4所示，應(yīng)用100 nmol/L的胰島素可以增加SH-SY5Y細(xì)胞活性。向細(xì)胞內(nèi)加入100 nmol/L胰島素培養(yǎng)12 h，與對照相比細(xì)胞活性明顯改善(P＜0.01)(圖4)。

圖4 MTT檢測胰島素對細(xì)胞活性的影響。Fig．4 Cell viability was determined by methylthiazole tetrazolium(MTT)assay．(#P ＜0.01)．

2.5 胰島素調(diào)節(jié)SIRT1表達(dá)

如圖5所示在對SH-SY5Y細(xì)胞應(yīng)用100 nmol/L胰島素12 h后SIRT1蛋白表達(dá)水平增加。提前加入PI3K抑制劑 LY294002(20 μM)，2 h后再加入胰島素，Western blotting結(jié)果顯示 PI3K抑制劑LY294002可以降低SIRT1蛋白表達(dá)，提示胰島素信號調(diào)節(jié) SIRT1表達(dá)(圖5)。

圖5 胰島素調(diào)節(jié)SIRT1表達(dá)。Fig．5 Insulin regulates the expression of SIRT1 protein．

3 討論

組蛋白去乙?；?(SIRT1)不但影響組蛋白乙?；癄顟B(tài)，而且可以通過影響某些轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子調(diào)節(jié)不同的生理過程。有研究顯示，SIRT1通過影響一些與能量代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，影響外周組織的能量代謝狀態(tài)［8］。Sirt1mRNA表達(dá)于POMC(pro-opiomelanocortin)神經(jīng)元，對腦組織的正常能量及糖原代謝過程中起著重要調(diào)節(jié)作用［9］。在外周胰島素抵抗的情況下，SIRT1可以抑制PPT1B(protein tyrosine phosphatase1B)的轉(zhuǎn)錄改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)［10］。胰島素受體在腦組織中表達(dá)廣泛，主要表達(dá)于皮層、海馬、下丘腦，參與正常的生理過程，腦部胰島素抵抗可導(dǎo)致腦部多種疾病的發(fā)生(如阿爾茨海默病等)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)SIRT1和胰島素受體(IR)在成年小鼠皮層、海馬、下丘腦神經(jīng)元存在定位，此外，體外研究顯示胰島素可以調(diào)節(jié)SIRT1的表達(dá)，表明其二者之間存在一定聯(lián)系影響腦部的生理及病理狀態(tài)。

近年來，染色質(zhì)重塑對學(xué)習(xí)記憶的調(diào)控作用越來越成為研究的熱點。本研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)豐富，且與IR存在明顯共定位現(xiàn)象。有報道顯示，SIRT1敲除小鼠其海馬CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)樹突分支減少、樹突長度變短，海馬依賴的短時程和長時程記憶力缺陷［11］。相反，在SIRT1過表達(dá)小鼠的學(xué)習(xí)記憶力明顯改善。臨床及流行病學(xué)研究顯示，患有2型糖尿病的患者其發(fā)展成阿爾茨海默病的概率明顯增加［12］。對患有阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的患者研究發(fā)現(xiàn)，其腦部胰島素及胰島素受體表達(dá)水平下降。而應(yīng)用胰島素治療可以通過調(diào) Aβ和磷酸化tau蛋白改善海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶力［13］。

在對胰島素β細(xì)胞特異性過表達(dá)SIRT1的轉(zhuǎn)基因小鼠研究發(fā)現(xiàn)，該模型小鼠的胰島素β細(xì)胞在糖原刺激下其分泌胰島素明顯增強［14］。肝臟特異性敲除SIRT1的小鼠模型出現(xiàn)胰島素抵抗病理狀態(tài)。綜上所述，SIRT1與2型糖尿病發(fā)病過程存在某種聯(lián)系。因此，推測SIRT1可能在腦部的胰島素分泌及疾病過程中起到關(guān)鍵性作用。接下來，我們將會在AD動物模型中進(jìn)一步研究SIRT1與胰島素信號通路之間是否存在一點聯(lián)系，這將會為AD機制研究提供新的探討。

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