不同劑量阿霉素致大鼠局灶節(jié)段硬化腎病模型的建立比較

馬曉紅，何立群

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 200021;2.上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 200021)

阿霉素(adriamycin，ADR)注射加單側腎切除為大鼠慢性腎臟病的經(jīng)典模型，文獻報道顯示ADR的注射劑量、注射途徑各有不同［1－9］，部分劑量不能誘導出腎臟局灶節(jié)段硬化(focal segmental glomerular sclerosis，F(xiàn)SGS)的病理改變，有些劑量模型雖然有

FSGS表現(xiàn)，但死亡率達15% ～56%［10］，我們?yōu)槊饕粋€既有FSGS表現(xiàn)，死亡率又低的ADR尾靜脈注射劑量，對不同劑量ADR致大鼠FSGS腎病模型的建立進行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級8周齡雄性SD大鼠，144只，體重(200±20)g，由上海西普爾 －必凱實驗有限公司提供，SCXK(滬)2008－0016。實驗大鼠分籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，SYXK(滬)2009－0069，溫度 25°、12 h 光照、45% 濕度的環(huán)境中，自由飲水，進食標準普通飼料。

1.1.2 藥物 注射用鹽酸多柔比星，10 mg/支，深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號1012E2。

1.1.3 主要試劑 尿蛋白定量試劑盒、尿素氮試劑盒、肌酐試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)。

1.1.4 主要儀器 M5型酶標儀(美國MD公司)，GL－20G－II型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)。MICROM HM 325輪轉切片機(美國MD公司)，Leica DMIL倒置相差顯微鏡(美國萊卡公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組:取144只SD大鼠隨機分為3組，正常組(n=18)，假手術組(n=18)，模型組(n=18)。模型組行單側腎切除，以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，備皮，用碘酒、75%酒精消毒手術區(qū)后鋪巾，距左脊肋骨1.5 cm處斜向外方切口，暴露腎臟，分離腎周脂肪后，切除左腎，結扎血管，逐層縫合，分別于術后第1周分成六個劑量組3 mg/kg、4 mg/kg、4.5 mg/kg、5 mg/kg、5.5 mg/kg、6 mg/kg，每個劑量組18只，行尾靜脈注射 ADR，每次0.6 mL。假手術組僅作背部切口，剝離左腎包膜，保留腎上腺，逐層縫合，于術后第1周尾靜脈注射等體積生理鹽水，每次0.6 mL。模型組、假手術組于術后第5周再次尾靜脈注射，重復前次劑量。

1.2.2 樣本收集及標本制備

1.2.2.1 收集血清、腎臟標本 ADR第二次注射后1周、4周、8周用代謝籠收集大鼠24 h尿，記尿量及飲水量;ADR第二次注射后2周、4周、8周目內皉取血;ADR第二次注射后8周，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，取出右側腎臟，稱重，去包膜，于10%甲醛固定備用組織病理切片。

1.2.2.2 標本制備 10%甲醛固定腎組織24 h后，脫水，包埋，切片備HE染色。

1.2.3 檢測指標 檢測模型大鼠生化指標:24 h尿蛋白定量、血清肌酐、血清尿素氮。HE染色觀察腎組織病理。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量資料以表示。多組間兩兩比較用單因素方差分析(以P＜0.05為差異進行統(tǒng)計檢驗)。采用 pearson法分析大鼠24 h尿蛋白定量、腎功能、成活率與 ADR注射劑量的相關性。

2 結果

2.1 各ADR注射劑量組大鼠成活率及與ADR注射劑量的相關性

不同ADR注射劑量組大鼠4周、8周成活率隨著注射劑量的升高呈逐漸下降趨勢，4周、8周時4.5 mg/kg組、5 mg/kg組、5.5 mg/kg組、6 mg/kg組成活率低于50%(表1)。

8周時各注射劑量組大鼠成活率與注射劑量呈高度顯著性負相關(圖1，r=0.904 5，P ＜0.01)。

表1 各組各組大鼠成活率比較(單位:%)Tab.1 Comparison of the survival rate among eight groups(unit:%)

圖1 8周大鼠成活率與ADR注射劑量的相關性曲線。Fig.1 The Relativity curve of the survival rate with ADR in eighth week．

2.2 各ADR注射劑量組大鼠24 h尿蛋白定量及與ADR注射劑量的相關性

ADR第二次注射后1周、4周、8周，各 ADR注射劑量組大鼠24 h尿蛋白定量與正常組相比均明顯升高(P＜0.01)(表2)。

8周時各注射劑量組大鼠24 h尿蛋白定量與ADR注射劑量呈高度顯著性正相關(圖 2，r=0.942 9，P ＜0.01)。

2.3 各ADR注射劑量組大鼠腎功能及與ADR注射劑量的相關性

ADR第二次注射后2周、4周、8周，各 ADR注射劑量組大鼠血清肌酐水平與正常組相比顯著升高(P＜0.01)(表3)。

血清尿素氮水平與正常組相比，各ADR注射劑量組大鼠在4周、8周時有明顯升高(P＜0.01);2周時4 mg/kg組較正常組升高(P＜0.05)，3 mg/kg組無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其余各組明顯升高(P＜0.01)(表 4)。

8周時各注射劑量組大鼠血清Scr與ADR注射劑量呈高度顯著性正相關(圖3，r=0.938 4，P＜0.01);血清BUN與ADR注射劑量呈高度顯著性正相關(圖 4，r=0.956 8，P ＜0.01)。

表2 各組24 h尿蛋白定量水平比較(單位:mg/24 h)Tab.2 Comparison of 24 h upq among eight groups(unit:mg/24 h)

2.4 各組大鼠腎臟外觀變化(彩插2圖5)

肉眼觀察:正常組、假手術組腎臟大小正常，色澤紅潤，表面光滑，腎包膜完整。各 ADR注射劑量組大鼠殘余腎呈腎代償性肥大，色澤蒼白，表面粗糙、布滿顆粒狀隆起，腎包膜不完整，和周圍組織無明顯粘連，殘腎易分離，腎臟外觀的改變隨著 ADR注射劑量的加大呈加重趨勢。

2.5 各組大鼠腎臟病理HE染色(200倍，400倍)(彩插3圖6)

光鏡(HE染色):正常組、假手術組腎小球未見明顯異常，系膜細胞無增生，毛細血管襻開放，血管壁正常，間質無明顯炎性細胞浸潤;各模型組大鼠腎臟可見腎小球增生、肥大、萎縮，上皮細胞空泡變性，腎小球系膜區(qū)增寬、系膜細胞明顯增生，腎小球出現(xiàn)局灶節(jié)段硬化，硬化區(qū)偶有泡沫細胞形成;腎小管輕中度濁腫、擴張，部分小管內可見蛋白管型和紅細胞;腎間質纖維化，可見大量炎性細胞浸潤。隨著ADR注射劑量的增加，腎小球硬化程度有逐漸加重的趨勢。

3 討論

阿霉素(ADR)腎病大鼠模型報道于上世紀80年代［11］，是目前公認的最接近人類腎小球疾病的模型。根據(jù)造模方法可分為急性腎病模型和慢性腎病模型，急性腎病模型類似于人類的微小病變型腎病(MCN)，慢性腎病模型則類似于人類慢性腎小球腎炎和局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)。該模型為目前腎臟病研究領域應用較多的造模方法之一，其腎毒性的發(fā)病機制主要有兩個方面:ADR是一種細胞周期非特異性的廣譜化療抗癌藥物，具有強烈的細胞毒作用，可直接損傷腎臟細胞，干擾足細胞的蛋白合成，造成足細胞的改變;其次ADR中的醒式結構在腎臟內還原為半醒型自由基，與氧反應產(chǎn)生活性氧，誘發(fā)腎小球上皮細胞脂質過氧化反應，破壞濾過膜，產(chǎn)生蛋白尿。ADR的腎臟病理改變與ADR的產(chǎn)地、給藥途徑、動物品系有密切關系［12］。

圖2 8周大鼠24 h尿蛋白定量與ADR注射劑量的相關性曲線。Fig.2 The Relativity curve of 24 hupq with ADR in eighth week．

表3 各組血清肌酐水平比較(單位:umol/L)Tab.3 Comparison of serum creatinine among eight groups(unit:umol/L)

表4 各組血清尿素氮水平比較(單位:mmol/L)Tab.4 Comparison of serum urea nitrogen among eight groups(unit:mmol/L)

圖3 8周大鼠血清肌酐與ADR注射劑量的相關性曲線。Fig.3 The Relativity curve of rat serum creatinine with ADR in eighth week．

圖4 8周大鼠血清尿素氮與ADR注射劑量的相關性曲線。Fig.4 The Relativity curve of rat serum urea nitrogen with ADR in eighth week．

由于ADR的心肌毒性和腹瀉等副作用極易引起模型動物的死亡，尤其是 ADR的心臟毒性［13］是模型大鼠死亡的主要原因，從而影響了實驗的效果。ADRN模型可模擬人類各種腎小球和腎小管疾?。?4－16］，所以我們采用不同注射劑量進行造模，評價不同劑量ADR的腎毒性、毒副作用，分析不同劑量ADR的造模效果，從而摸索出一個相對較優(yōu)的注射劑量。

我們在實驗中采取單側腎切除加重復尾靜脈注射的方法，分6個ADR注射劑量進行觀察，提示尿蛋白、血肌酐分別于造模后1周、2周出現(xiàn)明顯升高，且呈進行性加重，這個結果與ADR誘發(fā)腎小球上皮細胞脂質過氧化反應，破壞濾過膜有關;肌酐升高的同時血清尿素氮也有所升高，24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮的升高及成活率呈ADR注射劑量依賴。各注射劑量組大鼠腎臟均出現(xiàn)FSGS病理改變，腎小球硬化程度隨著ADR注射劑量的增加呈現(xiàn)出逐漸加重的趨勢，考慮可能為ADR的腎毒性所導致。不同ADR注射劑量組大鼠4周、8周時4.5～6 mg/kg組成活率低于50%，4 mg/kg組的8周成活率為61.1%，成活率的下降可能與ADR的注射劑量及其副作用有關。實驗結果提示:ADR注射劑量越大，F(xiàn)SGS的表現(xiàn)越重，Scr水平越高，腎功能越差;無論從外觀還是腎臟病理，3～6 mg/kg劑量組雖然都能出現(xiàn)FSGS的表現(xiàn)，但4～6 mg/kg劑量組死亡率高。故較之其余劑量組，國產(chǎn)ADR使用3 mg/kg注射劑量成模率高，死亡率最低，同時也符合人類FSGS表現(xiàn)，為ADRN較為理想的注射劑量。

因此，阿霉素腎病大鼠模型是應用較多的腎病經(jīng)典模型之一，其穩(wěn)定性及模型的成活率會直接影響實驗結果，而ADRN造模中注射藥物的產(chǎn)地、注射劑量及注射途徑的選擇決定著成模周期及成模率，部分劑量雖能誘導出大鼠腎臟局灶節(jié)段硬化，但死亡率較高，部分劑量不能誘導出腎臟FSGS。所以，理想的注射劑量有助于在成模的同時減少動物死亡，避免因死亡率高或成模率低對實驗結果造成的影響，由于國產(chǎn)ADR尾靜脈注射劑量3 mg/kg模型大鼠死亡率低，同時大鼠腎臟病理又能表現(xiàn)出符合人類腎小球 FSGS的改變，是較為理想的造模劑量。

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