HP-PRRSV原始株在抗體壓下傳代突變株抗原性及致病力變化研究

范書金 （山東省聊城市動物醫(yī)院 252000） 肖延光 趙愛民 魏雅茹 王素紅（山東省聊城市畜牧站）

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HP-PRRSV原始株在抗體壓下傳代突變株抗原性及致病力變化研究

范書金 （山東省聊城市動物醫(yī)院 252000） 肖延光 趙愛民 魏雅茹 王素紅（山東省聊城市畜牧站）

為了比較高致病性藍耳病山東分離株SD0612原始株及其在抗體選擇壓下突變株在回歸豬體后的抗體動態(tài)變化，試驗中，將15頭健康豬分為5組，分別為SD0612原毒感染組、有抗體條件下第1次傳40代突變株F40感染組及有抗體條件下再次傳40代突變株e40感染組、無抗體條件下再次傳40代突變株a40感染組及陰性對照組，分別于接毒后1周、2周、3周、4周、5周采血，收集血清以ELISA試劑盒測定其抗體水平。剖檢死亡豬及到期剖殺豬，取病料固定，石蠟切片，HE染色，鏡檢。結(jié)果顯示：F40在接種豬后引起的ELISA抗體較原始株遲緩，約滯后1周左右。而e40和a40誘發(fā)的抗體和F40未見明顯區(qū)別。4個毒株比較后發(fā)現(xiàn)，SD0612原始株感染豬后引發(fā)的ELISA抗體始終是最高的，顯示其在體內(nèi)的復(fù)制能力最強和抗原性最好。

高致病性藍耳病 分離株 抗體水平 免疫原性

我國于1995年在北京地區(qū)首次大規(guī)模暴發(fā)PRRS，郭寶清等于1996年首次從國內(nèi)疑似PRRS感染豬群中分離到PRRSV CH-1a株，證實了我國存在此病(郭寶清等，1996)，并相繼分離出BJ-4、HN1、HB-1、HB-2、SD、DQ和SA等多株P(guān)RRSV，且對其來源和遺傳學(xué)背景進行了探討。目前，國內(nèi)至少有22個省份報道過有本病的發(fā)生或流行，成為規(guī)?；B(yǎng)豬場的主要動物疫病之一。發(fā)病快、死亡率高、流行速度快、強度大、抗生素治療效果差或根本無效。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM干粉購自INVITROGEN公司，用于細胞培養(yǎng)液的制備。胎牛血清(FBS)購自美國GIBCO公司。甲醇、丙酮、甲醛、二甲苯等均為國產(chǎn)分析純，檢測PRRSV抗體的ELISA試劑盒購自美國IDEXX公司，萊卡石蠟切片機，蘇木素、伊紅染液。

1.2 HP-PRRSV原始毒株-SD0612 HP-PRRSV原始毒株SD0612為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授實驗室分離的野毒株，NSP2的分析顯示該毒株為NSP2缺失90bp的強毒變異株。測定TCID50后凍存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3 SD0612在抗體壓下的傳代毒株 將Marc-145培養(yǎng)于6孔板中，待細胞長滿單層后接毒，20ml/孔。6孔板第一行為系列I，培養(yǎng)液中添加10%陰性對照豬血清，又分為A、B、C三個平行的傳代系列；第二行為系列II，即培養(yǎng)液中含有10%的抗血清，又分為D、E、F三個平行的傳代系列。待細胞75%~80%出現(xiàn)病變時收獲病毒分裝凍存于-80℃冰箱。按上述分組對應(yīng)接種下一個六孔板，依次對應(yīng)傳代，連續(xù)傳代40代后得到各系列的傳代毒株A40-F40。

將上述傳代毒F40制備抗血清并按上述方法在新的抗體選擇壓下再連傳40代，得到新的傳代毒a40-f40。

試驗選取F40、a40及e40傳代毒株，毒株由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授研究室提供。

1.4 傳代毒株回歸試驗動物 購買健康一月齡長白豬15頭，由齊魯動物保健品有限公司提供。經(jīng)檢測PRRSV、PCV-2、PPV、CSFV等均為陰性且PRRSV抗體為陰性。

表 試驗動物分組及處理

編號組 別處理 A-1-3SD0612原始株接種組2×104TCID50/頭 B-1-3第1次傳代有抗體組突變株F40接種組6×106TCID50/頭 C-1-3第2次傳代有抗體組突變株e40接種組6×106TCID50/頭 D-1-3第2次傳代無抗體組突變株a40接種組6×106TCID50/頭 E-1-3空白對照組等體積PBS

1.5 接毒豬的臨床癥狀觀察及血常規(guī)變化檢測 接種毒株后每日定期測量各組實驗豬的體溫變化，仔細觀察臨床表現(xiàn)。以2ml無菌注射器吸取0.2ml肝素抗凝劑，然后于接毒后1、2、3、4、5周采血，每頭豬采血0.8ml，混勻后以全自動血細胞分析儀測定血常規(guī)。

1.6 接毒豬不同時期ELISA抗體檢測 應(yīng)用IDEXX試劑盒檢測血清PRRSV抗體，嚴格按說明書操作。

1.7 接種毒株后試驗豬剖檢病變及病理組織學(xué)變化 對試驗期間死亡的及5周到期剖殺的試驗豬剖檢，仔細觀察其眼觀病變，并取肺、脾、淋巴結(jié)、扁桃體、腦、肝、胃腸道等器官組織，10%的中性福爾馬林溶液固定，按常規(guī)方法制造石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察病理組織學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 接毒豬臨床表現(xiàn) （1）SD0612接種組：接種第2天體溫升至40~41.8℃，高熱稽留，臨死前1d體溫才開始下降，精神沉郁，喜臥；采食量下降或食欲廢絕，糞干；皮膚紫紅，耳部和四肢末段發(fā)紺，睪丸紅腫，有的皮膚表現(xiàn)點狀出血；呼吸困難，部分出現(xiàn)嚴重的腹式呼吸，有的表現(xiàn)喘氣或呈不規(guī)則呼吸；后期有鼻液或出血，部分患豬流清鼻涕，打噴嚏、咳嗽、眼分泌物增多，大部分豬有淚斑，出現(xiàn)結(jié)膜炎癥狀；有的豬便秘，糞便呈球狀，有的豬下痢，尿黃而少、混濁，發(fā)病2周左右病豬迅速死亡；有的病豬后肢無力，病豬瀕死前不能站立，有神經(jīng)癥狀，最后全身抽搐而死。死后呈敗血癥變化。（2）F40、e40、a40接種組：傳代突變株接種后均未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，個別豬接種后2~3d體溫稍升高達40℃，隨后很快恢復(fù)正常。（3）空白對照組：體溫及臨床表現(xiàn)均未見異常變化。

2.2 接毒豬血常規(guī)變化 SD0612原始株感染后白細胞總數(shù)顯著升高，3周時達到高峰，4周時開始下降。其血紅蛋白含量顯著下降，遠低于參考范圍，在3周時達到最低，4周時開始上升?？梢钥闯鯯D0612原始株感染后誘發(fā)較強的免疫反應(yīng)。而F40、e40及a40引起的血常規(guī)變化與原始株相似，但相對緩和。

2.3 接毒豬PRRSV抗體變化規(guī)律 四組接毒后PRRSV抗體水平逐步升高，不同的是SD0612原始株在第3周齡時即達到高峰，而F40、e40及a40感染組在第4周齡時才達到高峰，相對于原始株遲緩1周左右。

2.4 接毒豬的剖檢病變 （1）SD0612接種組：肺臟嚴重充血、暗紅色實變，有的可見細菌感染引發(fā)的胸膜炎和心包炎。全身淋巴結(jié)充血、腫脹，切面外翻、濕潤呈漿液性淋巴結(jié)炎病變，病情嚴重的病例全身淋巴結(jié)見出血性炎癥、切面呈大理石樣變。病變最為嚴重的是腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)。脾暗紅色腫大，表面常見米粒大出血丘疹。扁桃體充血、出血、腫脹。肝暗紅色腫大，或呈土黃色、質(zhì)脆，膽囊擴張或萎縮，膽汁濃稠。腎充血腫大，見點狀出血，膀胱積尿，尿呈棕黃色。（2）F40、e40及a40接種組：3組均未見明顯的眼觀病變，個別豬肺色暗紅稍顯硬實，肝色淡稍腫脹。（3）對照組：未見異常病變。

2.5 接毒豬病理組織學(xué)變化 （1）SD0612接種組：肺呈彌漫性、重度性間質(zhì)性肺炎，因大量巨噬細胞、淋巴細胞浸潤增生，肺泡壁顯著增厚，肺小葉間質(zhì)顯著增寬。支氣管及血管周圍炎性細胞呈圍管樣增生。腦均有不同程度的病毒性腦炎病變，可見明顯的血管袖套現(xiàn)象、衛(wèi)星現(xiàn)象、嗜神經(jīng)現(xiàn)象，神經(jīng)元變性壞死，膠質(zhì)細胞呈彌漫性或結(jié)節(jié)狀增生，軟腦膜下充血、出現(xiàn)，大量淋巴細胞浸潤。脾、淋巴結(jié)及扁桃體輕度充血、出血、淋巴細胞壞死。肝、腎、心等實質(zhì)器官普遍發(fā)生顆粒變性和水泡變性。（2）F40接種組：2頭豬的肺泡壁輕度增厚，淋巴細胞浸潤，肝細胞輕度顆粒變性及水泡變性，心肌輕度顆粒變性，豬腦血管充血，少量淋巴細胞浸潤；胸腺、扁桃體、脾及淋巴結(jié)均未見明顯的病理組織學(xué)變化，胃腸道未見明顯病變。（3）e40接種組：1頭豬的肺泡壁輕度增厚，淋巴細胞浸潤，肝細胞輕度顆粒變性及水泡變性；其它組織器官未見明顯病變。（4）a40接種組：1頭豬的肺泡壁輕度增厚，淋巴細胞浸潤，肝細胞輕度顆粒變性及水泡變性，心肌輕度顆粒變性，豬腦血管充血，少量淋巴細胞浸潤；胸腺、扁桃體、脾及淋巴結(jié)均未見明顯的病理組織學(xué)變化，胃腸道未見明顯病變。（5）對照組：未見明顯病變。

圖1 F40接種組病理學(xué)變化

圖2 e40接種組病理學(xué)變化

圖3 a40接種組病理學(xué)變化

3 討論

（1）病毒在細胞的長期自然傳代中，其復(fù)制能力和致病性會發(fā)生一些變化，這兩方面往往是相互影響的。很多弱毒疫苗即是由強毒經(jīng)多次傳代致弱后而來。而這些傳代均是在無抗體的情況下的自然傳代，對于PRRSV在有抗體情況下傳代后病毒的致病性和抗原性的變化尚未有研究報道。前期研究中發(fā)現(xiàn)，PRRSV在有抗體傳代情況下其ORF3和ORF5基因會發(fā)生很多的有義突變，通過血清交叉中和試驗發(fā)現(xiàn)病毒在抗體選擇壓下抗原性發(fā)生了改變。不同代次的基因突變毒株其毒力是否也同樣會發(fā)生明顯改變，是否還保留原有的抗原性，這兩個需注意問題。因此對PRRSV原始株及其在抗體壓下不同傳代株在回歸豬體后的抗體動態(tài)變化規(guī)律及病理學(xué)變化進行了比較研究。（2）結(jié)果顯示，SD0612在有抗體情況下連續(xù)傳代40代后的突變株F40在接種豬后引起的ELISA抗體較原始株遲緩，約滯后1周左右。而F40在有抗體或無抗體情況下連續(xù)傳代40代后的突變株e40和a40誘發(fā)的抗體和F40未見明顯區(qū)別。4個毒株比較后發(fā)現(xiàn)，SD0612原始株感染豬后引發(fā)的ELISA抗體始終是最高的，顯示其在體內(nèi)的復(fù)制能力最強和抗原性最好。而突變株的抗原性稍有變化，這種變化是否會影響其免疫保護作用，有待于進一步實驗驗證。（3）SD0612原始株接種組迅速出現(xiàn)高致病性藍耳病的典型病癥，于接種10~13d后死亡，剖檢及病理組織學(xué)病變也完全符合高致病性藍耳病的典型病變。而3株突變株除一過性發(fā)燒外，未見其它癥狀，剖檢也未見明顯的眼觀病變，但鏡檢1/3的豬見肺泡壁輕度增厚，少量淋巴細胞浸潤，肝細胞輕度顆粒變性及水泡變性，各毒株間未見明顯的差異，表明突變株的致病力顯著下降，已成“非致病性”弱毒株，但安全性還是存在一定的隱患。致弱突變株回歸豬后其毒力是否還會返強，這也是需注意的問題，有待于進一步驗證。

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（2012–07–13）

S813.3

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