蛋白印跡法檢測壽胎丸對反復(fù)自然流產(chǎn)模型小鼠子宮蛻膜的蛋白表達(dá)

雷 磊，李慧芳，譚展望，羅 蕾，盧麗麗

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)分子病理實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙410208；2.河北省婦幼保健中心婦女保健科，河北 石家莊050031）

前期通過雙相電泳及質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)并鑒定了30 個(gè)可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及壽胎丸干預(yù)相關(guān)的蛋白質(zhì)，提示壽胎丸可調(diào)節(jié)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠蛻膜組織多種蛋白質(zhì)的表達(dá)[1]。課題組曾探討壽胎丸對反復(fù)自然流產(chǎn)小鼠母胎界面SOCS1 和SOCS3 蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明壽胎丸可能通過降低小鼠母胎界面SOCS1 蛋白表達(dá)及提高SOCS3 蛋白表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控Th 細(xì)胞向Th2 方向分化，故對反復(fù)自然流產(chǎn)有治療作用[2-3]。本文應(yīng)用蛋白印跡（western blot）技術(shù)對部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。希望通過上述研究，對母胎界面的病理生理提供更為全面和有價(jià)值的信息，進(jìn)而從分子水平探討壽胎丸安胎的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治復(fù)發(fā)性流產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性CBA/J 小鼠50 只，SPF 級，8 周齡，體質(zhì)量（19.7±2.3）g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0004；健康雄性DBA/2 小鼠20 只，SPF 級，8 周齡，體質(zhì)量 （24.7±2.5）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005；健康雄性BALB/C小鼠5 只，SPF 級，8 周齡，體質(zhì)量（23.2±1.8）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

壽胎丸由菟絲子、續(xù)斷、桑寄生和阿膠4 味中藥飲片按2∶1∶1∶1 比例組成，將前3 味藥混和，置圓底燒瓶中，加10 倍量水，加熱回流提取2 h，提取液濾過，殘?jiān)?0 倍量水繼續(xù)加熱回流提取2 h，提取液濾過，合并2 次濾液，阿膠烊化于濾液中，濃縮至含生藥量1 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器

BMJ-1 生物組織包埋機(jī)（天津航空機(jī)電公司）；Shandon325 石蠟切片機(jī) （英國Shandon 公司）；LEICA DM LB2 雙目顯微鏡（德國LEICA 公司）；Motic B5 顯微攝像系統(tǒng) （麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）；MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北航公司）；低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；紫外分光光度計(jì) （美國Beckmen 公司）；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽及電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；圖像掃描儀（美國Bio-Rad 公司）；Kodak Digital Science ID 圖像分析系統(tǒng) （美國Kodak 公司）。

1.4 主要試劑

兔抗鼠熱休克蛋白27（HSP27）抗體、兔抗鼠α烯醇化酶（α-enolase）抗體、兔抗鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin）抗體、兔抗鼠膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2）抗體、兔抗鼠β-actin 抗體、PVDF 膜、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、DAB 顯色試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒均購自美國Bethyl 公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模方法[4]

將50 只雌性CBA／J 小鼠分別與20 只雄性DBA／2 和5 只BALB／c 小鼠按2∶1 合籠交配，檢到陰栓者計(jì)為妊娠第0 d，分別建立反復(fù)自然流產(chǎn)模型40 只與正常妊娠模型10 只。

2.2 動(dòng)物分組及給藥方法

CBA／J×BALB／c 孕鼠作為正常妊娠組（10 只），CBA／J×DBA／2 孕鼠作為反復(fù)自然流產(chǎn)模型（40只），按妊娠順序隨機(jī)分為模型組、壽胎丸低、中、高劑量組，每組10 只。壽胎丸劑量根據(jù)成人70 kg 臨床用量按動(dòng)物體表面積換算，灌胃容積均為0.4 mL／20 g。其中壽胎丸低劑量組為臨床等效劑量，低、中、高劑量組給藥劑量分別為含生藥量3、6、12 g／kg。正常妊娠組和模型對照組給予相同體積蒸餾水，連續(xù)灌胃給藥14 d。

2.3 標(biāo)本制備方法

孕14 d 斷頸處死小鼠，妊娠子宮離體后，自子宮角處鈍性撕開子宮壁，將胎兒胎盤單位從著床部位剝離，用小號(hào)組織剪刀分離著床部位的蛻膜組織，取5 個(gè)著床部位，用預(yù)冷的PBS 沖洗干凈后，迅速置液氮中保存。

2.4 western blot 分析方法

將蛻膜組織從液氮中取出，加入適量蛋白裂解液（按50 mg 標(biāo)本用1 mL 裂解緩沖液），冰浴裂解1 h，12 000 r/min，4 ℃離心45 min，取上清即為蛻膜組織總蛋白。蛋白質(zhì)濃度測定采用Amersham Biosciences 公司專門針對蛋白質(zhì)組學(xué)研究的蛋白質(zhì)抽提設(shè)計(jì)的2D Quant Kit 定量試劑盒。50 μg 總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，分離后的蛋白10 V恒壓25 min 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1∶200 稀釋的HSP27 一抗4 ℃孵育過夜，再置于1∶1 000 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液中室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色曝光。同時(shí)以β-actin 作為上樣量的內(nèi)參照，將所得X 光片掃描，記錄下來的照片通過計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組指標(biāo)與β-actin的光密度比值，作為HSP27、α-enolase、Transferrin、Annexin A2 的相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 小鼠蛻膜組織HSP27 表達(dá)水平比較

以β-actin 蛋白作為內(nèi)參，計(jì)算HSP27/β-actin比值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，小鼠模型組與正常組相比，蛻膜HSP27 表達(dá)明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；壽胎丸高、中、低劑量組與模型組相比，蛻膜HSP27 表達(dá)均降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；壽胎丸高劑量組蛻膜HSP27 表達(dá)較中、低劑量組明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1和圖1。

表1 小鼠蛻膜HSP27 表達(dá)水平比較 （±s，n=10）

表1 小鼠蛻膜HSP27 表達(dá)水平比較 （±s，n=10）

注：與模型組比較**P＜0.01；與壽胎丸高劑量組比較☆☆P＜0.01。

組 別模型組正常組壽胎丸高劑量組壽胎丸中劑量組壽胎丸低劑量組劑量（g/kg）——1 263 HSP27/β-actin 0.663 0±0.001 3 0.214 4±0.001 2**0.203 8±0.001 7**0.287 8±0.001 6**☆☆0.297 8±0.001 2**☆☆

圖1 HSP27 在各組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)電泳圖

3.2 小鼠蛻膜組織α-enolase 表達(dá)水平比較

以β-actin 蛋白作為內(nèi)參，計(jì)算α-enolase/βactin 比值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，小鼠模型組與正常組相比，蛻膜α-enolase 表達(dá)明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；壽胎丸高、中、低劑量組與模型組相比，蛻膜α-enolase 表達(dá)均降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；壽胎丸高劑量組蛻膜α-enolase 表達(dá)與中、低劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2和圖2。

3.3 小鼠蛻膜組織Transferrin 表達(dá)水平比較

以β-actin 蛋白作為內(nèi)參，計(jì)算Transferrin/βactin 比值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：小鼠模型組與正常組相比，蛻膜Transferrin 表達(dá)明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；壽胎丸高劑量組與模型組相比，蛻膜Transferrin 表達(dá)升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；壽胎丸中、低劑量組與模型組相比，蛻膜Transferrin 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見表3和圖3。

表2 小鼠蛻膜α-enolase 表達(dá)水平比較 （±s，n=10）

表2 小鼠蛻膜α-enolase 表達(dá)水平比較 （±s，n=10）

注：與模型組比較**P＜0.01。

組 別模型組正常組壽胎丸高劑量組壽胎丸中劑量組壽胎丸低劑量組劑量（g/kg）——1 263 α-enolase/β-actin 0.421 9±0.001 1 0.330 9±0.001 1**0.311 9±0.001 3**0.311 1±0.001 4**0.311 5±0.001 5**

圖2 各組中α-enolase 的表達(dá)電泳圖

表3 小鼠蛻膜Transferrin 表達(dá)水平比較 （±s，n=10）

表3 小鼠蛻膜Transferrin 表達(dá)水平比較 （±s，n=10）

注：與模型組比較**P＜0.01；與壽胎丸高劑量組比較☆☆P＜0.01。

組 別模型組正常組壽胎丸高劑量組壽胎丸中劑量組壽胎丸低劑量組劑量（g/kg）——1 263 Transferrin/β-actin 0.2611±0.0012 0.4912±0.0011**0.4501±0.0012**0.2626±0.0015☆☆0.2632±0.0016☆☆

圖3 各組中Transferrin 的表達(dá)電泳圖

3.4 小鼠蛻膜組織Annexin A2 表達(dá)水平比較

以β-actin 蛋白作為內(nèi)參，計(jì)算Annexin A2/βactin 比值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，小鼠模型組與正常組相比，蛻膜Annexin A2 表達(dá)明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；壽胎丸高、中、低劑量組與模型組相比，蛻膜Annexin A2 表達(dá)均升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；壽胎丸高劑量組蛻膜Annexin A2 表達(dá)較中、低劑量組明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表4和圖4。

表4 小鼠蛻膜Annexin A2 表達(dá)水平比較 （±s，n=10）

表4 小鼠蛻膜Annexin A2 表達(dá)水平比較 （±s，n=10）

注：與模型組比較**P＜0.01；與壽胎丸高劑量組比較☆☆P＜0.01。

組 別模型組正常組壽胎丸高劑量組壽胎丸中劑量組壽胎丸低劑量組劑量（g/kg）——1 263 Annexin A2/β-actin 0.333 4±0.001 3 0.549 8±0.001 1**0.536 5±0.001 3**0.462 0±0.001 2**☆☆0.462 6±0.001 2**☆☆

圖4 各組中Annexin A2 表達(dá)的影響電泳圖

4 討論

Western blot 技術(shù)是一種利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性，快速、靈敏地檢測和鑒定蛋白質(zhì)的技術(shù)，它將蛋白質(zhì)的電泳分離和免疫學(xué)鑒定結(jié)合在一起，該技術(shù)有效克服了免疫沉淀技術(shù)中的某些不足 （如抗原須用同位素標(biāo)記、緊密相關(guān)大分子的共沉淀、抗原的溶解度等)，非常實(shí)用而被廣泛接受。用SDS、尿素或還原劑(2-巰基乙醇等)增溶抗原混合物后，進(jìn)行SDS-PAGE，然后將被分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，并與之不可逆地結(jié)合。隨后封閉薄膜上非特異性的抗體結(jié)合位點(diǎn)，再與靶抗體特異性結(jié)合，最終與HRPO-Ig 偶聯(lián)物保溫，從顏色反應(yīng)的深度探測膜上印跡蛋白抗原的存在與含量[5]。

前期研究建立了模型組、正常組、壽胎丸高、中、低劑量組小鼠蛻膜組織的2-DE 圖譜，通過比較各組雙向凝膠電泳圖譜的差異，發(fā)現(xiàn)并鑒定了30 個(gè)可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及壽胎丸干預(yù)相關(guān)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的功能涉及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、蛻膜組織血管的重建及蛻膜細(xì)胞的凋亡等[1]。由于在實(shí)驗(yàn)過程中，可能會(huì)出現(xiàn)假陽性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故采用Western-blot 從蛋白質(zhì)水平進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證得到的陽性結(jié)果才是真正的差異表達(dá)蛋白質(zhì)[6]。

Hsp27 是小分子熱休克蛋白，與妊娠的關(guān)系逐漸受到重視，其與滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、胎兒發(fā)育、分娩發(fā)動(dòng)、子癇前期發(fā)病密切相關(guān)[7]。Hsp27 可能通過直接影響細(xì)胞骨架蛋白結(jié)構(gòu)或通過影響MMP-2 活性，而干擾滋養(yǎng)細(xì)胞遷移，影響胎盤形成[8]。Hsp27 是P29 雌激素受體連接蛋白，可與雌激素受體相互作用，影響胎兒發(fā)育[9]。α 烯醇化酶（α-enolase）普遍存在于生物體內(nèi)。在糖酵解過程中，它催化a 磷酸甘油形成磷酸烯醇式丙酮酸。主要參與過敏性反應(yīng)、低氧耐受性、控制生長等多種細(xì)胞生理過程，并且還是幾種細(xì)胞表面纖溶酶的受體和激活物[10]。轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin）-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（Transferrin R）途徑是哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞生理?xiàng)l件下主要的攝鐵途徑，同樣在胎盤鐵轉(zhuǎn)運(yùn)中也起關(guān)鍵作用。胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞母體側(cè)（頂膜）主要表達(dá)Transferrin R1，母體血液中Fe3+-Transferrin 與STB 頂膜上TransferrinR1 結(jié)合成Transferrin-TransferrinR 復(fù)合物被內(nèi)吞，在內(nèi)吞小體酸性環(huán)境下，F(xiàn)e3+從Tf 中釋放，脫鐵Transferrin 和TransferrinR 被運(yùn)回胞外可繼續(xù)利用[11]。膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2） 是鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白Annexins 家族的重要成員之一，研究顯示，子疒間前期患者Annexin A2 表達(dá)水平下調(diào)，可能會(huì)增加凝血酶的合成，進(jìn)而促進(jìn)妊娠期高凝狀態(tài)的形成，從而在子疒間前期的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。此外，來自栓塞性腦卒中大鼠模型的證據(jù)表明靜脈注射重組Annexin A2 能明顯抑制體內(nèi)血栓的形成[12]。

本研究采用Western blot 法檢測了模型組、正常組、壽胎丸高、中、低組小鼠蛻膜組織的HSP27、α-enolase、Transferrin、Annexin A2，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果一致，從一定程度上證明了蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性及其結(jié)果的準(zhǔn)確性；壽胎丸通過下調(diào)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠蛻膜組織HSP27、α-enolase 蛋白的表達(dá)，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善蛻膜組織的缺氧狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)ATP 的產(chǎn)生途徑，同時(shí)上調(diào)Transferrin、Annexin A2 蛋白的表達(dá)，提高攝取母血鐵能力，改善蛻膜組織的高凝狀態(tài)，預(yù)防血栓形成，保持血流通暢，從而實(shí)現(xiàn)維持妊娠，降低胚胎丟失率，這可能是其安胎的作用機(jī)制之一。

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