血栓前狀態(tài)分子與冠心病血瘀證的相關(guān)性研究

王 萍，黃獻(xiàn)平，王麗萍，喻松仁，孫安會，袁肇凱

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208；2.江西中醫(yī)學(xué)院，江西 南昌330000）

血栓前狀態(tài)(Prethrombotic state，PTS)，既往稱血液高凝狀態(tài)，是在血管內(nèi)皮細(xì)胞及凝血、抗凝、纖溶系統(tǒng)以及血流動力學(xué)等多種因素改變的綜合作用下發(fā)生的一種病理過程。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為冠心病具有一定的遺傳性，且普遍存在著血栓前狀態(tài)，而血瘀證作為中醫(yī)證候概念下許多疾病的一種血液運(yùn)行不暢的病理階段，被認(rèn)為與PTS 有著密切的關(guān)系。血瘀證是冠心病有規(guī)律的一種病理表型，其血栓前狀態(tài)分子是否存在著一定遺傳性值得探討，本研究以具有遺傳特征的家系人群為對象，探討PTS 分子與冠心病血瘀證的關(guān)系，同時對冠心病血瘀證非家系人群進(jìn)行同步對照研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象

冠心病血瘀證患者來源于2010年1月～2011年l月湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院、湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院病人以及在長沙砂子塘社區(qū)、梨子山社區(qū)、長沙冶金研究設(shè)計院等單位進(jìn)行冠心病血瘀證遺傳流行病學(xué)調(diào)查中符合診斷標(biāo)準(zhǔn)和納入標(biāo)準(zhǔn)的冠心病人?！肮谛牟　?診斷參照1979年國際心臟病學(xué)會/美國心臟協(xié)會及WHO 冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)，須排除疾病的診斷均按相關(guān)的國際診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。冠心病“血瘀證”的診斷參照《中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》及國家中藥管理局醫(yī)政司胸痹急癥組和中國中醫(yī)藥學(xué)會心病專業(yè)委員會《中醫(yī)心病診斷療效標(biāo)準(zhǔn)與用藥規(guī)范》進(jìn)行?！肮谛牟⊙鲎C家系”定義為先證者的一級親屬(包括父母、同胞及子女)中至少有1 人為冠心病血瘀證患者。

本研究納入對象基本情況如下：A 組：家系冠心病血瘀證組，24 例，其中男14 例，女性10 例，平均年齡（65.38±9.64）歲；B 組：家系冠心病非血瘀證組，9 例，其中男1 例，女性8 例，平均年齡（69.89±8.07）歲；C 組：家系非冠心病血瘀證組，14 例，其中男5例，女性9 例，平均年齡（62.43±8.27）歲；D 組：家系健康人組，10 例，其中男4 例，女性6 例，平均年齡（43.70±20.54）歲；E 組：非家系冠心病血瘀證組，21例，其中男6 例，女性15 例，平均年齡（69.24±6.40）歲；F 組：非家系健康人對照組，7 例，其中男3 例，女性4 例，平均年齡（55.29±11.16）歲。IBM SPSS statistics 19.0 軟件對各組間性別構(gòu)成和平均年齡進(jìn)行分析，結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

1.2 研究方法

納入對象均于清晨空腹靜脈取血，分離血漿或血清，按各血栓前狀態(tài)分子標(biāo)記物檢測要求進(jìn)行測定。其指標(biāo)如下 （1）血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷分子標(biāo)記物：血漿血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）；（2）血小板活化分子標(biāo)記物：血小板表面P-選擇素（P-Selectin）；（3）凝血系統(tǒng)激活及微量纖維蛋白形成分子標(biāo)記物：凝血酶原片段1、2（F1+2）、可溶性纖維蛋白單體（SFMC）；（4） 纖溶系統(tǒng)分子標(biāo)記物：組織型纖溶酶原激活物（tPA）、纖溶酶原激活物抑制物（PAI-1）；（5）抗凝系統(tǒng)分子標(biāo)記物：凝血酶-抗凝血酶III 復(fù)合物（TAT）。

各血栓前狀態(tài)分子標(biāo)記物的檢測均按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。酶標(biāo)儀450 nm 波長檢測各孔的吸光度 （OD 值）。測定在加終止液15 min 內(nèi)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品曲線擬合

各指標(biāo)檢測出標(biāo)準(zhǔn)品OD 值，根據(jù)OD 值與已知標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行曲線擬合，此處采用MasterPlex 2010 軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式（y=a+bx+cx^2）擬合。

2.2 PTS 分子標(biāo)記物的計算

運(yùn)用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各組相應(yīng)的分子標(biāo)記物值。由于實(shí)驗(yàn)誤差所致，各組值通過IBM SPSS statistics 19.0 進(jìn)行分析，剔除離群值和極端值進(jìn)行分析。各組的PTS 分子標(biāo)記物的平均濃度如表1。

表1 各組PTS 分子標(biāo)記物的平均測定濃度 （±s）

表1 各組PTS 分子標(biāo)記物的平均測定濃度 （±s）

組 別 n TM (μg/L) n P-Seletin (pg/mL) n F1+2 (nmol/L) n SFMC (μg/mL) n t-PA (μg/L) n PAI-1 (ng/L) n TAT (pmol/mL) A 23 19.33±5.97 22 367.41±93.99 24 895.75±449.44 23 45.83±17.66 23 12.17±3.57 23 705.37±224.44 24 27.87±8.55 B 7 14.08±1.88 8 287.32±41.34 8 668.78±222.46 8 29.63±2.12 8 9.30±1.08 8 559.98±75.82 7 18.58±2.07 C 11 15.08±1.36 12 326.41±72.82 11 615.32±84.75 12 36.25±12.12 11 9.16±0.68 9 488.75±37.84 12 20.05±5.75 D 9 13.78±1.57 9 294.77±21.09 9 535.22±106.25 9 32.61±6.28 9 9.50±0.54 9 550.25±70.58 9 19.95±2.03 E 17 13.95±1.44 18 306.24±34.28 18 503.80±115.32 18 32.68±4.28 19 9.00±0.77 20 523.65±120.89 20 19.16±4.18 F 7 26.00±15.01 7 519.70±298.09 6 803.56±437.01 6 48.44±21.73 6 12.84±4.85 5 625.10±232.74 7 29.83±14.65

2.3 PTS 分子標(biāo)記物的統(tǒng)計分析

各組結(jié)果采用IBM SPSS statistics 19.0 進(jìn)行分析，由于各組間方差齊性分析P＜0.05，方差不齊，故采用oneway annova (Tamhane)進(jìn)行各組間的均數(shù)比較。結(jié)果如下：

2.3.1 家系冠心病血瘀證與家系各組間比較。TM:冠心病血瘀證與冠心病非血瘀證、非冠心病血瘀證和健康人比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 （P 值分別為0.016，0.048，0.005），TM 的含量較后三者高。P-Selectin：冠心病血瘀證與冠心病非血瘀證和健康人比較有統(tǒng)計學(xué)差異 （P 值分別為0.048，0.031），P-Selectin 含量較后二者高，與非冠心病血瘀證比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.938）。F1+2：冠心病血瘀證與健康人比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.015），F(xiàn)1+2 含量較后者高，與冠心病非血瘀證和非冠心病血瘀證無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.674，0.096）。SFMC：冠心病血瘀證與冠心病非血瘀證有統(tǒng)計學(xué)差異 （P=0.004），SFMC 含量較后者高，與非冠心病血瘀證和健康人比無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.657，0.058）。t-PA：冠心病血瘀證與冠心病非血瘀證、非冠心病血瘀證及健康人比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 （P=0.028，0.010，0.028），t-PA 含量較 后 三者高。PAI-1：冠心病血瘀證與非冠心病血瘀證有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.002），含量較后者高，與冠心病非血瘀證和健康人比較無統(tǒng)計學(xué)差異 （P=0.160，0.086）。TAT：冠心病血瘀證與冠心病非血瘀證、非冠心病血瘀證及健康人比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 （P =0.001，0.042，0.003），含量較后三者高。

2.3.2 非家系兩組間的比較。冠心病血瘀證各血栓前狀態(tài)分子與健康人比較均無統(tǒng)計學(xué)差異 （TM：P=0.705，P-Selectin：P=0.817，F(xiàn)1+2：P=0.920，SFMC：P=0.889，t -PA：P =0.828，PAI -1：P =0.999，TAT：P =0.806）。

3 討論

TM 是一種普遍存在于細(xì)胞膜表面具有較強(qiáng)抗凝活性的跨膜糖蛋白。有研究表明TM 的下降與血瘀證存在著線性關(guān)系[1]，本研究結(jié)果表明家系冠心病血瘀證的TM 水平較家系健康人高，也高于家系冠心病非血瘀證和家系非冠心病血瘀證，與其他研究結(jié)果不一致。而t-PA 和PAI-1 是纖溶系統(tǒng)的主要成分，是纖溶系統(tǒng)關(guān)鍵性調(diào)節(jié)物質(zhì)，二者之間的動態(tài)平衡對維持正常的血液流動具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，冠心病患者的血漿t-PA 活性減低，PAI-1 活性增高，但本研究結(jié)果表明家系冠心病血瘀證的PAI-1 水平與家系健康人比較無明顯差異，而t-PA 水平高于家系健康人，也與其他研究結(jié)果不一致。凝血酶原片段1+2（F1+2）是在血液凝固過程中因子Xa 復(fù)合物水解凝血酶原后所生成的多肽片段。檢測F1+2 在血漿中的水平，可較靈敏地反映Ⅹa 的活性及凝血狀態(tài)，在冠心病患者的研究中也較健康人水平增加[4]。P-選擇素(P-Selectin)介導(dǎo)血小板黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，激活中性粒細(xì)胞，釋放血管活性物質(zhì)和氧代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致血管收縮，阻塞小血管從而啟動血栓形成過程，其在CHD 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5-6]。TAT 是凝血酶被抗凝血酶III 中和后形成的，能使凝血酶被滅活，是反映凝血酶生成和活性增高的敏感分子標(biāo)志物，在冠心病中較健康人水平增加[7]。本研究結(jié)果表明家系冠心病血瘀證患者P-Selectin、F1+2、TAT的血漿水平較健康人組高，與其他研究結(jié)果相同。

家系人群研究中冠心病血瘀證患者與健康人比較能抑制凝血的分子TM、t-PA 水平增加，促進(jìn)凝血的P-Selectin、F1+2、TAT 等分子水平也增加。為何這兩種相互拮抗的分子同時增加，是后續(xù)研究需要探討的問題。這種現(xiàn)象在冠心病血瘀證與冠心病非血瘀證比較中也有體現(xiàn)。

在非家系的人群研究中冠心病血瘀證與健康人比較，各種PTS 分子的水平均無明顯差別。從數(shù)據(jù)分析可知，非家系人群的PTS 分子水平在個體間差異較大，這是否是由于研究設(shè)計或檢測方法的缺陷所致，還是說明PTS 分子在家系人群中具有較為穩(wěn)定的遺傳表現(xiàn)特征，也是值得繼續(xù)研究的方向。

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