克癃膠囊對(duì)BPH腎虛血瘀證大鼠前列腺增生和性激素水平的影響

樊新榮，何清湖，顏 苗

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙41007；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410011）

克癃膠囊是結(jié)合多年治療前列腺增生癥(Benign Prostatic Hyperplasia，BPH)的臨床經(jīng)驗(yàn)與現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果擬定化裁的組方，主要治療中醫(yī)辨證為腎虛血瘀證的患者，課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)克癃膠囊對(duì)中醫(yī)證候總體療效和中醫(yī)證候積分的改善有顯著的治療優(yōu)勢(shì)，并驗(yàn)證了克癃膠囊治療BPH的有效性和安全性[1]。BPH 是增生的前列腺壓迫前列腺尿道或影響膀胱尿道口梗阻，出現(xiàn)尿頻、排尿困難，甚則尿液無(wú)法排出的病癥，是中老年男性的常見病和多發(fā)病。何清湖[2-3]通過(guò)審癥求因、臨床驗(yàn)證、微觀辨證佐證三個(gè)層面探討B(tài)PH 病因病機(jī)，認(rèn)為腎虛是BPH 發(fā)生的基本條件，血瘀是BPH 病理改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腎虛和血瘀相互影響，構(gòu)成了BPH 的病理機(jī)制。本研究是以臨床廣泛應(yīng)用的保列治和中藥前列癃閉通為對(duì)照，觀察治療前后克癃膠囊對(duì)BPH腎虛血瘀證大鼠前列腺、性激素水平的影響，探討克癃膠囊抑制前列腺增生的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康成年雄性SD 大鼠72 只，體質(zhì)量230～280 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2009-0004。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫為（23±2）℃，相對(duì)濕度為（60±10）%。

1.1.2 儀器 AG204-N 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托力多有限公司）；AF100 型制冰機(jī)（意大利斯科茨曼公司）；Dyy-Ⅲ-6B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠）；顯微手術(shù)器械（上海手術(shù)器械公司）；解剖顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；3K18 型低溫離心機(jī)（德國(guó)SIGMA 公司）；7001×UVI 型數(shù)字彩色顯微圖像分析系統(tǒng) （英國(guó)UVI 公司）；GC-1500r 型放射免疫計(jì)數(shù)器 （科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；Biofuge fresco 4 ℃離心機(jī)（美國(guó)SORVALL 公司）；RM2125 石蠟切片機(jī) （德國(guó)Leica 公司）；MK3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）。

1.1.3 試劑和藥物 碘[125I]雙氫睪酮放射免疫分析藥盒、碘[125I]雌二醇放射免疫分析藥盒、FSH-放免分析藥盒、LH-放免分析藥盒均購(gòu)自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。Trizol 試劑盒購(gòu)自SIGMA 公司。克癃膠囊為中試產(chǎn)品，批號(hào)：1000814，規(guī)格：0.35 g/粒，由楊凌和田生物科技有限公司生產(chǎn)。前列癃閉通片：0.5 g/片，批號(hào)：090301，由湖南藥圣堂制藥有限公司生產(chǎn)。非那雄胺（保列治），規(guī)格5 mg/片，批號(hào)：285922，由Merck&Co,Inc.（U.S.A）生產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物分組及給藥方法

課題組采用去勢(shì)手術(shù)、激素注射和冰浴方法已成功建立BPH 腎虛血瘀證大鼠模型，并通過(guò)考察前列腺濕重、前列腺指數(shù)和血清前列腺特異性酸性磷酸酶（PAP）含量以及觀察模型大鼠病理組織形態(tài)學(xué)，對(duì)此模型的成功復(fù)制進(jìn)行了評(píng)價(jià)（另文發(fā)表）。前期研究確定克癃膠囊正常成人量為3.15 g/d，按《動(dòng)物與人體的每公斤體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表》查出成人與大鼠每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)（W）為6.25，按人與大鼠之間用藥劑量換算公式：大鼠的劑量（mg/kg）=W×人的劑量（mg/kg）設(shè)計(jì)克癃膠囊大鼠的低、中、高給藥劑量分別為0.175、0.350、0.700 g/（kg·d）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為6 組，每組12 只?？瞻讓?duì)照組（簡(jiǎn)稱空白組）普通飼養(yǎng)，自29 d 起，給予0.1 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃；模型組大鼠在造模成功后第2日給予0.1 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃；其他各組在造模成功后第2日按下述方法給藥：保列治組按照0.520 mg/（kg·d）保列治片溶液灌胃；前癃通組按照0.625 g/（kg·d）前列癃閉通片溶液灌胃；克癃膠囊低劑量組（簡(jiǎn)稱克癃低組）、克癃膠囊中劑量組（簡(jiǎn)稱克癃中組）、克癃膠囊高劑量組（簡(jiǎn)稱克癃高組）分別按照0.175、0.350、0.700 g/（kg·d）配制克癃膠囊溶液灌胃。以上各組后續(xù)給藥均為每日1 次，連續(xù)4 周。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 前列腺濕質(zhì)量檢測(cè)及指數(shù)的計(jì)算 取出前列腺，仔細(xì)分離各葉前列腺，用電子天平稱大鼠前列腺濕質(zhì)量，并根據(jù)電子分析天平測(cè)量的大鼠體質(zhì)量計(jì)算前列腺指數(shù)。

前列腺指數(shù)=前列腺濕質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×100%

1.3.2 前列腺組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 （1）脫水及包埋：將固定好的前列腺組織經(jīng)常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。（2） 切片：連續(xù)切片，片厚5 μm，每隔20 張取蠟帶貼于涂有蛋白甘油的載玻片上。（3）HE 染色：常規(guī)蘇木精-伊紅染色，脫水、透明、封片。（4）觀察：光學(xué)顯微鏡下觀察前列腺的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.3.3 血清性激素水平的檢測(cè) 腹主動(dòng)脈取血，加入肝素鈉抗凝，15 min 后用低溫離心機(jī)離心10 min(3 000 r/min)，分離血清置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存，送湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院同位素科用放射免疫法測(cè)定各組大鼠血清睪酮(T)、雌二醇(E2)、卵泡刺激素（FSH）和黃體生成素（LH）含量。先將校準(zhǔn)品或樣品、標(biāo)記物和抗體按程序規(guī)定依次加入試管中，使標(biāo)記和非標(biāo)記抗原與有限量抗體互相競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，待反應(yīng)平衡后，加入分離劑，離心沉淀，使游離抗原與抗原抗體復(fù)合物分離，測(cè)量沉淀物的放射性強(qiáng)度。分別隨T、E2、FSH、LH 含量的增加，其放射性強(qiáng)度則相應(yīng)降低。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、前列腺濕質(zhì)量和前列腺指數(shù)的比較

各組大鼠治療后體質(zhì)量比較顯示：空白組、模型組兩組大鼠體重?zé)o顯著性差異(P＞0.05)；與模型組比較，克癃中、高劑量組大鼠體質(zhì)量無(wú)差異(P＞0.05)，保列治組、克癃低劑量組大鼠體質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

各組大鼠治療后前列腺濕質(zhì)量比較顯示：與空白組比較，模型組前列腺濕質(zhì)量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組比較，保列治組、克癃低、中、高劑量組的前列腺濕重均減小(P＜0.05)；與保列治組比較，克癃中、高劑量組的前列腺濕重?zé)o顯著性差異(P＞0.05)，克癃低組前列腺濕質(zhì)量增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

各組大鼠治療后前列腺指數(shù)比較顯示：與空白組比較，模型組前列腺指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，保列治組、克癃低、中、高組前列腺指數(shù)均減小(P＜0.05)；與保列治組比較，克癃中、高劑量組前列腺指數(shù)減小(P＜0.05)；與克癃中、高劑量組比較，克癃低組前列腺指數(shù)均增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、前列腺濕質(zhì)量和前列腺指數(shù)比較 （±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、前列腺濕質(zhì)量和前列腺指數(shù)比較 （±s）

注：與空白組比較＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較●P＜0.05；與保列治組比較▲P＜0.05；與前癃通組比較★P＜0.05；與克癃中組比較■P＜0.05；與克癃高組比較▼P＜0.05。

組 別空白組模型組保列治組前癃通組克癃低組克癃中組克癃高組n 藥物劑量（kg·d）10 9 10— —9998 0.520 mg 0.625 g 0.175 g 0.350 g 0.700 g大鼠體質(zhì)量（g）484.85±20.57 471.43±22.32 399.56±17.53●411.36±21.29●440.00±17.62●■▼472.22±19.77 476.14±19.82前列腺質(zhì)量濕質(zhì)量（mg）0.16±0.02 0.33±0.07＃＃0.16±0.06●0.17±0.02●0.22±0.04●▲★0.17±0.02●0.16±0.03●前列腺指數(shù)（%）0.033±0.002 0.070±0.005＃0.040±0.006●0.041±0.003●0.050±0.005●■▼0.036±0.004●▲★0.034±0.002●▲★

2.2 各組大鼠前列腺組織病理學(xué)變化的比較

HE 染色結(jié)果顯示（圖1），空白組前列腺上皮細(xì)胞排列清楚，腺上皮單層柱狀，可見少許扁平狀基底細(xì)胞及明顯基底膜，腔大，腔內(nèi)充滿分泌物，間質(zhì)、纖維組織含量無(wú)增加。模型組可見腺上皮皺縮，部分區(qū)域?qū)哟卧黾?，排列紊亂，多數(shù)腺上皮呈乳頭狀突向腔內(nèi)成鋸齒狀，腺體僵硬感，腔內(nèi)分泌物少，間質(zhì)增寬，結(jié)締組織增生，間質(zhì)纖維組織及平滑肌組織增多。保列治組，可見腺上皮出現(xiàn)增生并出現(xiàn)分泌現(xiàn)象，多為單層柱狀，前列腺腺體大小接近，排列整齊，間質(zhì)結(jié)締組織增生，但較模型組大大減輕。前癃通組，可見腺上皮增生不明顯，腺腔分泌物少，間質(zhì)細(xì)胞增生，但結(jié)締組織增生不明顯。克癃低組，可見腺上皮增生，腺腔分泌物少，間質(zhì)細(xì)胞輕微增生，結(jié)締組織增生不明顯?？笋薪M可見腺上皮有增生跡象，腺腔內(nèi)見分泌物，間質(zhì)細(xì)胞增生，結(jié)締組織無(wú)增生?？笋呓M可見腺上皮增生跡象，腺腔內(nèi)見分泌物，間質(zhì)細(xì)胞增生，結(jié)締組織無(wú)增生。

圖1 大鼠前列腺組織HE 染色（×250 倍）

2.3 各組大鼠血清性激素水平的比較

2.3.1 各組大鼠血清T 和E2含量的比較 與空白組比較，模型組血清T 含量有顯著性升高(P＜0.01)、血清E2含量顯著降低(P＜0.01)；與模型組比較，保列治組、克癃低組血清T 含量和E2含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，前癃通組、克癃中、高劑量組血清T 含量降低(P＜0.05)、血清E2含量顯著升高(P＜0.01)；與前癃通組比較，克癃中、高劑量組血清T 和E2含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清T 及E2 含量的比較 （±s，μg/mL）

表2 各組大鼠血清T 及E2 含量的比較 （±s，μg/mL）

注：與空白組比較＃＃P＜0.01；與模型組比較●P＜0.05，●●P＜0.01。

組 別空白組模型組保列治組前癃通組克癃低組克癃中組克癃高組藥物劑量（kg·d）n T E2— —0.520 mg 0.625 g 0.175 g 0.350 g 0.700 g 10 9 10 9998 0.19±0.026 0.28±0.028＃＃0.28±0.015 0.24±0.025●0.27±0.029 0.23±0.023●0.22±0.031●10.93±0.62 7.31±0.38＃＃7.37±0.22 9.05±0.53●●7.35±0.26 9.51±0.41●●9.87±0.44●●

2.3.2 各組大鼠血清促性腺激素FSH 和LH 含量的比較 與空白組比較，模型組血清FSH 和LH 的含量升高(P＜0.05)；與模型組比較，保列治組血清FSH 和LH 的含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，前癃通組、克癃低、中、高劑量組血清FSH 和LH 的含量降低(P＜0.05)；與前癃通組比較，克癃低、中、高劑量組血清FSH 和LH 的含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

表3 大鼠血清卵泡雌激素FSH 和黃體生成素LH 含量 （±s，mIU/mL）

表3 大鼠血清卵泡雌激素FSH 和黃體生成素LH 含量 （±s，mIU/mL）

注：與空白組比較＃P＜0.05；與模型組比較●P＜0.05。

組 別空白組模型組保列治組前癃通組克癃低組克癃中組克癃高組LH 5.15±0.15 7.58±0.99?！?.50±0.74 6.12±0.49●6.54±0.44●6.08±0.35●5.99±0.42●藥物劑量（kg·d）n— —0.520 mg 0.625 g 0.175 g 0.350 g 0.700 g 10 9 10 9998 FSH 4.28±0.57 5.14±0.42＃※5.16±0.46 4.65±0.31●5.01±0.34●4.70±0.42●4.43±0.24●

3 討論

3.1 克癃膠囊對(duì)BPH 腎虛血瘀證模型大鼠體質(zhì)量、前列腺濕重、前列腺指數(shù)的影響

BPH 是由前列腺組織病理性增生而導(dǎo)致的疾病，選擇測(cè)量前列腺組織濕重并計(jì)算前列腺指數(shù)，可以宏觀地顯示出前列腺組織增生的情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，克癃膠囊各劑量組均可明顯降低BPH 大鼠的前列腺濕重和前列腺指數(shù)，抑制大鼠前列腺增生，有效緩解了前列腺增生的靜力性因素。但是高、中、低劑量組之間在該作用的發(fā)揮方面有所差別，顯示出劑量依賴性。克癃膠囊、保列治和前癃通片在對(duì)前列腺濕質(zhì)量的影響方面沒(méi)有差別，但在對(duì)前列腺指數(shù)的影響方面，克癃膠囊優(yōu)于保列治和前癃通片。本實(shí)驗(yàn)中體質(zhì)量參數(shù)主要用于計(jì)算前列腺指數(shù)，雖然前癃通組、保列治組和克癃低劑量組使動(dòng)物體質(zhì)量相比模型組顯著降低（P＜0.05），但動(dòng)物體質(zhì)量受環(huán)境、飼養(yǎng)方法、給藥過(guò)程等因素的影響，其降低還不能說(shuō)明藥物對(duì)動(dòng)物體質(zhì)量有直接的影響，而應(yīng)依據(jù)“藥物安全性評(píng)價(jià)”的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.2 克癃膠囊對(duì)BPH 腎虛血瘀證模型大鼠前列腺組織病理學(xué)的影響

研究表明BPH 主要是間質(zhì)細(xì)胞的增生。間質(zhì)和腺性上皮部分的比例在正常前列腺是4∶1,但在BPH則達(dá)到6∶1[4]。本實(shí)驗(yàn)的BPH 大鼠前列腺組織病理切片觀察結(jié)果顯示：模型組腺上皮皺縮，部分區(qū)域?qū)哟卧黾?，排列紊亂，多數(shù)腺上皮呈乳頭狀突向腔內(nèi)呈鋸齒狀，腺體僵硬感，腔內(nèi)分泌物少，間質(zhì)增寬，有充血，結(jié)締組織增生，間質(zhì)纖維組織及平滑肌組織增多；保列治組可見腺上皮出現(xiàn)增生并出現(xiàn)分泌現(xiàn)象，多為單層柱狀，前列腺腺體大小接近，排列整齊，間質(zhì)結(jié)締組織增生，但較模型組大大減輕，接近假手術(shù)組；前癃通組可見腺上皮增生不明顯，腺腔分泌物少，間質(zhì)細(xì)胞增生，但結(jié)締組織增生不明顯；克癃膠囊各劑量組腺上皮增生，腺腔內(nèi)見分泌物，間質(zhì)細(xì)胞輕微增生，結(jié)締組織無(wú)增生。從中可以看出，模型組的前列腺增生主要以間質(zhì)增生為主，這與大部分報(bào)道相類似?？笋z囊可以明顯抑制模型大鼠前列腺增生的進(jìn)程，從病理學(xué)上的改善是疾病好轉(zhuǎn)的重要指征，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克癃膠囊治療后，BPH 大鼠前列腺的組織病理學(xué)明顯改善，顯示克癃膠囊能夠明顯抑制BPH 大鼠前列腺腺體和腺上皮的增生，更重要的是有效地抑制間質(zhì)和結(jié)締組織的增生。

3.3 克癃膠囊治療BPH 的作用機(jī)制分析

眾多學(xué)者認(rèn)為，BPH 的發(fā)生是雄激素與雌激素相互協(xié)同作用的結(jié)果，這種協(xié)同作用主要體現(xiàn)在E2和T 的比例關(guān)系上，E2和T 二者比例關(guān)系失衡是BPH 發(fā)生的重要因素。而性激素的產(chǎn)生又受到垂體分泌的促性腺激素即FSH 和LH 的控制。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，模型組比空白組的血清T含量顯著性升高(P＜0.01)、血清E2含量顯著降低(P＜0.01)、血清FSH 和LH 的含量升高(P＜0.05)，提示血清T、FSH 和LH 含量的升高及E2含量的下降是BPH 的產(chǎn)生因素。與模型組比較，克癃膠囊中、高劑量組血清T 含量降低(P＜0.05)，E2含量顯著升高(P＜0.01)，克癃低組血清T 含量和E2含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，顯示克癃膠囊在調(diào)節(jié)BPH 的性激素T 和E2方面有劑量相關(guān)性；克癃低、中、高劑量組血清FSH 和LH 的含量降低(P＜0.05)，顯示克癃膠囊在調(diào)節(jié)影響B(tài)PH 形成的性激素FSH 和LH 方面劑量相關(guān)性不明顯。與模型組比較，前癃通組血清T、FSH和LH 含量降低(P＜0.05)、血清E2含量顯著升高(P＜0.01)，顯示前癃通也對(duì)BPH 性激素具有調(diào)節(jié)作用。與模型組比較，保列治組血清T、E2、FSH 和LH 含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，顯示保列治對(duì)BPH 的性激素水平無(wú)顯著影響，這一結(jié)果與保列治的作用機(jī)制和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論相符[5-6]。

綜上所述，在降低BPH 腎虛血瘀證模型大鼠的前列腺濕質(zhì)量方面，克癃膠囊、前列癃閉通片和保列治具有相同的作用。但是保列治、前列癃閉通片對(duì)機(jī)體的體質(zhì)量也有影響，而克癃膠囊中、高組則對(duì)體質(zhì)量沒(méi)有影響，并且克癃膠囊對(duì)BPH 模型大鼠血清性相關(guān)激素水平的紊亂具有調(diào)節(jié)作用，表明克癃膠囊是通過(guò)多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)的途徑達(dá)到治療BPH的作用。

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