環(huán)媒恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)在寄生蟲檢測(cè)中的應(yīng)用*

童群波 陸紹紅

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所，杭州 310013)

寄生蟲病的危害仍是普遍存在的公共衛(wèi)生問題，在發(fā)展中國家，特別在熱帶和亞熱帶地區(qū)，寄生蟲病依然廣泛流行,威脅著無數(shù)兒童和成人的健康甚至生命。聯(lián)合國開發(fā)計(jì)劃署/世界銀行/世界衛(wèi)生組織聯(lián)合倡議的熱帶病特別規(guī)劃要求防治的6類主要熱帶病中，除麻風(fēng)病外，其余5類都是寄生蟲病，即瘧疾(Malaria)、血吸蟲病(Schistosomiasis)、絲蟲病(Filariasis)、利什曼病(Leishmaniasis)和錐蟲病(Trypanosomiasis)。臨床上對(duì)寄生蟲病的檢測(cè)經(jīng)歷了病原學(xué)診斷和免疫學(xué)診斷后，分子生物學(xué)診斷方法也日益發(fā)展，特別是PCR技術(shù)作為一種高效的核酸擴(kuò)增技術(shù)在寄生蟲病檢測(cè)方面發(fā)揮了重大作用，但是PCR操作必須有高精密的熱循環(huán)儀器和凝膠成像儀，使其在基層和現(xiàn)場(chǎng)開展受到嚴(yán)重制約。Notomi等(2000)首先提出一種全新的核酸擴(kuò)增技術(shù)——環(huán)媒恒溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)，它是一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏、特異的核酸擴(kuò)增方法,針對(duì)靶基因的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，F(xiàn)IP, BIP, F3 和B3(圖1)，在鏈置換DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下高效擴(kuò)增靶基因。首先，內(nèi)引物FIP與模板F2c 結(jié)合，在 Bst DNA聚合酶的作用下啟動(dòng)鏈DNA合成，外引物F3與模板F3c 結(jié)合并合成與模板DNA互補(bǔ)的單鏈，同時(shí)置換出FIP引物合成的DNA鏈。BIP與置換鏈DNA雜交，開始新鏈的合成。然后B3引導(dǎo)合成FIP引物合成鏈的互補(bǔ)鏈，置換釋放BIP引物合成鏈，被置換的單鏈DNA均存在互補(bǔ)序列，發(fā)生自我堿基配對(duì)，兩端各自形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是LAMP基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結(jié)合，開始新一輪的鏈置換合成，周而復(fù)始，形成高效率的擴(kuò)增，擴(kuò)增的最后產(chǎn)物為大量長(zhǎng)短不一的DNA鏈。其特點(diǎn)包括：(1) 不需要昂貴的PCR儀等設(shè)備，只需恒溫裝置，如水浴鍋；(2)擴(kuò)增效率高，在水浴恒溫(60～65℃),反應(yīng)3O～60 min可使低拷貝數(shù)的DNA擴(kuò)增達(dá)109水平；(3)結(jié)果判斷簡(jiǎn)單，LAMP技術(shù)在核酸合成過程中，從脫氧核酸三磷酸基質(zhì)(dNTPs)中析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子結(jié)合，產(chǎn)生大量白色焦磷酸鎂沉淀，因此，可以通過渾濁度直接肉眼觀察，或者通過反應(yīng)前加入鈣黃綠素來觀察顏色的變化，也可以通過濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，無需電泳。作為一種新的核酸擴(kuò)增方法，LAMP被逐漸應(yīng)用于寄生蟲、病毒、微生物的檢測(cè),在疾病的快速檢測(cè)方面發(fā)展迅速，是最有發(fā)展前景的快速診斷方法之一，現(xiàn)將LAMP技術(shù)在寄生蟲檢測(cè)方面的應(yīng)用綜述如下。

圖1 環(huán)媒恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)引物設(shè)計(jì)Fig.1 Primer design for Loop-mediated isothermal amplication

1 蠕蟲

1.1 吸蟲

1.1.1日本血吸蟲Schistosomajaponicum：楊秋林等(2008)開展了應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測(cè)日本血吸蟲尾蚴的實(shí)驗(yàn)研究,設(shè)計(jì)4條擴(kuò)增尾蚴鈣結(jié)合蛋白基因的LAMP引物，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，LAMP可檢測(cè)到尾蚴的最低數(shù)量為1條。Xu等(2010)針對(duì)日本血吸蟲高度重復(fù)的轉(zhuǎn)座子SjR2基因序列設(shè)計(jì)引物，DNA最小檢測(cè)量達(dá)到 0.08 fg，敏感性是傳統(tǒng)PCR的104，能夠檢測(cè)感染血吸蟲尾蚴1周后的兔血清。經(jīng)吡喹酮治療，12周后無法檢測(cè)到血清中的日本血吸蟲基因組DNA。Wang等(2011)同樣根據(jù)SjR2設(shè)計(jì)引物，LAMP方法能檢測(cè)出感染1周后兔血清中的血吸蟲DNA，而傳統(tǒng)的PCR方法需要在感染2周后才能檢測(cè)到。分別進(jìn)行青蒿琥酯和吡喹酮治療后檢測(cè)不到血清中的DNA。這些結(jié)果表明LAMP方法對(duì)于血吸蟲感染的早期診斷及評(píng)價(jià)藥物的療效是有效的。Kumagai等(2010)建立了基于28S核糖體(Sj28S)的LAMP方法，設(shè)計(jì)的引物特異性良好，與曼氏血吸蟲S.mansoni無交叉反應(yīng)。用PCR和LAMP法平行檢測(cè)日本血吸蟲感染的釘螺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP法與PCR法檢測(cè)的靈敏度同樣，最低檢測(cè)限度為100 fg，能夠檢測(cè)出釘螺Oncomelaniahupensis感染1個(gè)毛蚴1 d后的血吸蟲DNA。同時(shí)群體檢測(cè)結(jié)果顯示LAMP能擴(kuò)增1個(gè)感染的釘螺混合100個(gè)陰性釘螺的混合樣本中的血吸蟲DNA，因此可應(yīng)用LAMP方法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)樣本的群體檢測(cè)，從而預(yù)測(cè)流行區(qū)的感染風(fēng)險(xiǎn)。

1.2 絳蟲

1.2.1細(xì)粒棘球絳蟲Echinococcusgranulosus：徐祥珍等(2011)根據(jù)囊型棘球蚴病病原細(xì)粒棘球絳蟲線粒體12S rRNA序列的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)4條LAMP反應(yīng)引物，用LAMP技術(shù)檢測(cè)我國較為流行的細(xì)粒棘球絳蟲DNA，以家犬體內(nèi)常見的泡狀帶絳蟲TaeniahydatigenaDNA為對(duì)照，評(píng)價(jià)該技術(shù)檢測(cè)棘球蚴病的特異性。結(jié)果顯示該引物與泡狀帶絳蟲不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性；同時(shí)，對(duì)不同稀釋度細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)能檢測(cè)到含1個(gè)蟲卵的DNA樣本，提示該法具有較高的敏感性。因此，LAMP技術(shù)有望成為檢測(cè)棘球蚴病病原感染的新方法，并可用于終宿主棘球絳蟲感染的常規(guī)監(jiān)測(cè)。

1.2.2帶絳蟲Taenia：Nkouawa等(2009)根據(jù)絳蟲組織蛋白酶樣半胱氨酸肽酶(clp)和細(xì)胞色素c氧化酶亞基1(Cox1)基因設(shè)計(jì)LAMP引物，建立檢測(cè)帶絳蟲的LAMP方法。其中根據(jù)Cox1基因建立的LAMP方法可以區(qū)分3個(gè)種，而根據(jù)clp基因建立的LAMP可以區(qū)分有鉤絳蟲T.solium和無鉤絳蟲T.saginata或亞洲帶絳蟲T.asiatica，通過限制性酶消化LAMP產(chǎn)物又可區(qū)分無鉤絳蟲和亞洲帶絳蟲。隨后，Nkouawa等(2012)應(yīng)用這個(gè)方法鑒別人攜帶的帶絳蟲的亞種。從35個(gè)帶蟲者中分離到51個(gè)節(jié)片，LAMP鑒定結(jié)果顯示有9個(gè)為豬帶絳蟲Taeniasolium，1個(gè)為亞洲帶絳蟲T.asiatica，另外41個(gè)為牛帶絳蟲T.saginata，結(jié)果顯示LAMP方法能夠用于帶絳蟲的快速鑒別，有助于帶絳蟲病的預(yù)防和控制。

1.3 線蟲

1.3.1廣州管圓線蟲Angiostrongyluscantonensis：Chen等(2011)建立了基于廣州管圓線蟲18s rRNA的LAMP方法，最低能檢測(cè)到1 fg的基因組DNA，比PCR方法敏感。另外還進(jìn)行了交叉反應(yīng)性研究，此方法與剛地弓形蟲Toxoplasmagondii、惡性瘧原蟲Plasmodiumfalciparum、日本血吸蟲S.japonicum華支睪吸蟲Clonorchissinensis、衛(wèi)氏肺吸蟲Paragonimuswestermani和異尖線蟲Anisakis均無交叉反應(yīng)。用此LAMP方法檢測(cè)人工感染廣州管圓線蟲35 d后的福壽螺Pomaceacanaliculatasnails，均為陽性，說明對(duì)于福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的檢測(cè)是有效的。Liu等(2011)建立了一種特異性的LAMP方法檢測(cè)褐云瑪瑙螺Achatinafulica內(nèi)廣州管圓線蟲DNA，引物基于rDNA的第一轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(The first internal transcribed spacer，ITS-1)，與簡(jiǎn)單異尖線蟲Anisakissimplexs.s, 毛首扁形線蟲Trichuristrichiura，犬弓蛔蟲Toxocaracanis，旋毛蟲Trichinellaspiralis及人蛔蟲Ascarislumbricoides均無交叉反應(yīng)，比傳統(tǒng)的PCR方法相敏感10倍，最低檢出DNA達(dá)到0.01 ng/μL。為了評(píng)價(jià)此方法的應(yīng)用價(jià)值，從流行區(qū)收集檢測(cè)了45個(gè)褐云瑪瑙螺，PCR方法檢出率為46.7%(21/45)，而LAMP方法為51.1%(23/45)，提示LAMP方法比傳統(tǒng)PCR方法更敏感。

1.3.2異尖線蟲Anisakis：鄭洋妹等(2010)根據(jù)簡(jiǎn)單異尖線蟲Anisakissimplexs.sITS保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了快速鑒定該蟲的LAMP方法。對(duì)10倍比稀釋的簡(jiǎn)單異尖線蟲ITS序列重組質(zhì)粒進(jìn)行靈敏性試驗(yàn),靈敏度達(dá)到10拷貝/μL；用典型異尖線蟲Anisakistypica、對(duì)盲囊線蟲Contracaecumsp.、針蛔線蟲Raphidascaristrichiuri作為對(duì)照進(jìn)行特異性試驗(yàn)，無交叉反應(yīng)；應(yīng)用建立的LAMP方法檢測(cè)7份經(jīng)PCR—RFLP鑒定為簡(jiǎn)單異尖線蟲的樣品，結(jié)果均為陽性，顯示建立的LAMP方法靈敏性高、特異性強(qiáng)，是檢測(cè)簡(jiǎn)單異尖線蟲的有效手段。

2 原蟲

2.1 瘧原蟲Plasmodium

瘧疾是世界上危害最嚴(yán)重的寄生蟲病之一，人體瘧原蟲主要有惡性瘧原蟲Plasmodiumfalciparum、間日瘧原蟲P.vivax、三日瘧原蟲P.malariae和卵形瘧原蟲P.ovale4種。近年來建立了以18S rRNA為檢測(cè)靶標(biāo)的可鑒別這四種瘧原蟲的LAMP方法(Poonetal., 2006; Hanetal., 2007; Parisetal., 2007; Yamamuraetal., 2009)。Han等(2007)根據(jù)人瘧原蟲18S rRNA建立LAMP方法，對(duì)4種瘧原蟲進(jìn)行了臨床診斷，并與顯微鏡檢和巢式PCR進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，對(duì)于三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲，LAMP檢測(cè)18S rDNA的最低檢出限為1O個(gè)拷貝。而對(duì)于惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲檢出限為100個(gè)拷貝。其檢出準(zhǔn)確性與巢式PCR完全相符，但相比巢式PCR耗時(shí)更短，不需要復(fù)雜的過程，只需熱處理過的血樣即可作為模板，4種瘧原蟲均可在40 min內(nèi)完成LAMP檢測(cè)。LAMP實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單可靠，既可用于瘧疾流行區(qū)監(jiān)測(cè)，也可用于實(shí)驗(yàn)室診斷。Sirichaisinthop等(2011)把上述LAMP方法應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)診斷，同時(shí)與鏡檢方法比較。110份血液樣品中60份鏡檢陽性的樣品檢出59份為陽性(敏感性98.3%)，50份鏡檢陰性的樣品全部為陰性(特異性100%)。LAMP的陰性預(yù)測(cè)值和陽性預(yù)測(cè)值分別為98%和100%，表明LAMP方法是現(xiàn)場(chǎng)診斷瘧疾的有效工具。Lu等(2012)用LAMP方法、巢式PCR和鏡檢方法診斷間日瘧。164例采自我國中部瘧疾流行區(qū)的鏡檢陽性樣本中，LAMP方法檢出160例間日瘧原蟲，敏感性為97.6%，而巢式PCR檢出162例，敏感性為98.8%，LAMP方法簡(jiǎn)便易行，表明LAMP方法在瘧疾流行區(qū)診斷間日瘧是可行的。陳勤等(2011)利用此LAMP方法對(duì)采自云南、海南省的惡性瘧患者血樣進(jìn)行瘧原蟲檢測(cè)，并與鏡檢和巢式PCR結(jié)果作比較，評(píng)估其檢測(cè)疫區(qū)惡性瘧患者血中瘧原蟲的特異性和敏感性。共檢測(cè)78份惡性瘧患者和3O份健康人血樣，其中72份患者血樣LAMP檢測(cè)為陽性，以鏡檢法為金標(biāo)準(zhǔn)，LAMP篩檢的靈敏度為92.3%、特異性為100%，陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為100%和83.3%；以巢式PCR為參考，LAMP篩檢的靈敏度為97.2%，特異性為94.4%，顯示LAMP方法檢測(cè)惡性瘧原蟲的敏感度和特異性與巢式PCR方法相近，可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)惡性瘧原蟲的檢測(cè)。

2.2 弓形蟲Toxoplasma gondii

Kong等(2012)根據(jù)529 bp重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，建立了一種新的LAMP方法，反應(yīng)在65℃下進(jìn)行1 h，弓形蟲基因組DNA的最低檢測(cè)量為0.6 fg，比基于B1基因的LAMP和基于 529 bp重復(fù)序列的巢式PCR檢出敏感性分別高100和1 000倍，而且與伊氏錐蟲Trypanosomaevansi、惡性瘧原蟲P.falciparum、日本血吸蟲S.japonicum、衛(wèi)氏并殖吸蟲Paragonimuswestermani、肝片吸蟲Fasciolahepatica和廣州管圓線蟲A.cantonensis的DNA無交叉反應(yīng)性。用此LAMP方法能檢測(cè)感染剛地弓形蟲RH株速殖子1 d后的小鼠血樣,首次報(bào)道了LAMP能用于實(shí)驗(yàn)室感染小鼠的弓形蟲早期診斷。陳道楨等(2011)選用構(gòu)建的弓形蟲Bl基因質(zhì)粒為陽性模板，建立LAMP檢測(cè)弓形蟲的方法，并進(jìn)行特異性和敏感性評(píng)估，在此基礎(chǔ)上建立LAMP檢測(cè)弓形蟲的定量體系及通過顯色反應(yīng)直接判斷結(jié)果的簡(jiǎn)便方法，最后應(yīng)用建立的方法對(duì)57例孕婦外周血標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，因此有望在臨床檢測(cè)中發(fā)揮一定的作用。Krasteva等(2009)選取剛地弓形蟲的SAG1基因設(shè)計(jì)引物，LAMP實(shí)驗(yàn)與傳統(tǒng)PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

2.3 錐蟲Trypanosoma

I型布氏岡比亞錐蟲Trypanosomabruceigambiense是引起非洲錐蟲病(Human African trypanosomiasis，HAT)的主要致病原，岡比亞HAT精確診斷始終缺乏有效的方法，Njiru等(2008)根據(jù)涎傳錐蟲亞屬的重復(fù)插入活動(dòng)因子(Repetitive insertion mobile element, RIME)建立了LAMP方法，只需25 min即可做出鑒定。Njiru等(2011)采用岡比亞錐蟲特異的糖蛋白基因 (TgsGP)為模板，敏感性相當(dāng)于能檢測(cè)10 個(gè)錐蟲/mL提取DNA或煮沸血液上清中1個(gè)錐蟲/mL，而傳統(tǒng)PCR的敏感性大約在10～1 000個(gè)錐蟲/mL。

2.4 隱孢子蟲Cryptosporidium

隱孢子蟲是一種危害嚴(yán)重的人獸共患、機(jī)會(huì)致病性病原，它們感染免疫功能正常的宿主后并不引起嚴(yán)重臨床癥狀，當(dāng)機(jī)體抵抗能力下降或免疫功能不全時(shí)，其繁殖能力和致病能力增強(qiáng)，患者出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和體征，甚至危及生命。Bakheit等(2008)從南非的牛、綿羊和馬的糞便中提取隱孢子蟲DNA，根據(jù)隱孢子蟲18S rRNA序列，用巢式PCR方法檢測(cè)全部為陰性，而用LAMP方法檢測(cè)有1/3以上的樣本為陽性。研究表明LAMP技術(shù)比巢式PCR更敏感。袁忠英等(2009)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)牛糞中提取的隱孢子蟲卵囊DNA，根據(jù)隱孢子蟲18S rRNA序列設(shè)計(jì)4對(duì)隱孢子蟲特異引物，利用LAMP檢測(cè)牛糞中隱孢子蟲卵囊DNA和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲GiardialambliaDNA，以正常牛糞DNA為陰性對(duì)照。結(jié)果隱孢子蟲卵囊DNA為陽性，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲DNA為陰性，具有良好的特異性。

2.5 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲Giardia lamblia

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲是一種重要的人獸共患寄生原蟲，分布于全世界，由該寄生蟲感染引發(fā)的腹瀉可在人和動(dòng)物之間通過水源、食物等途徑廣泛傳播，引起暴發(fā)流行。Plutzer等(2009)利用LAMP技術(shù)對(duì)35份樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中陽性24份，常規(guī)PCR檢測(cè)23份陽性；利用LAMP法成功地?cái)U(kuò)增了0.548 pg賈第鞭毛蟲集聚體B的DNA和0.8 pg賈第鞭毛蟲集聚體A的DNA；特異性實(shí)驗(yàn)顯示LAMP法只能擴(kuò)增賈第鞭毛蟲集聚體A和B，其他寄生蟲均不能擴(kuò)增。盧維媛等(2010)利用體外培養(yǎng)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體，提取DNA，建立LAMP技術(shù)檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的方法, 結(jié)果顯示藍(lán)氏賈第鞭毛蟲為陽性，與安氏隱孢子蟲DNA、惡性瘧原蟲DNA無交叉反應(yīng)性。

2.6 巴貝西蟲 Babesia

巴貝西蟲是一類血液寄生型原生動(dòng)物，經(jīng)蜱傳播，主要侵染犬、牛、馬類等脊椎動(dòng)物，患病動(dòng)物主要表現(xiàn)為發(fā)熱、黃疸、貧血等癥，近年來，在人類中也發(fā)現(xiàn)巴貝西蟲病的存在。Guan等(2008)設(shè)計(jì)了2對(duì)分別針對(duì)巴貝西臨潭株Babesiasp.BQ1(Lintan)和巴貝西新疆株Babesiasp. Xinjiang 18S rRNA的LAMP引物，用來檢測(cè)感染的羊血和純化的巴貝西蟲提取的DNA。對(duì)于巴貝西臨潭株和巴貝西新疆株的最小檢測(cè)量分別為0.02 pg和0.2 pg。 365份從甘肅采集的感染巴貝西蟲的綿羊血，其中14.3%(52/365)LAMP檢測(cè)為陽性。145份從新疆放牧的綿羊采集的樣品中，3.5%(5/145)LAMP檢測(cè)為陽性，結(jié)果表明LAMP方法能作為巴貝西蟲感染的新的檢測(cè)方法。Liu等(2012)設(shè)計(jì)了2對(duì)分別針對(duì)牛巴貝西蟲B.bovis和雙芽巴貝西蟲B.bigemina轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer，ITS)的引物，最小檢測(cè)量都達(dá)到0.1 pg，優(yōu)于傳統(tǒng)的PCR方法。這個(gè)方法已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室感染的牛血樣本和現(xiàn)場(chǎng)的牛血樣本進(jìn)行了驗(yàn)證評(píng)估。因此對(duì)于巴貝西蟲流行的國家，LAMP方法在流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)語

作為一種新的核酸擴(kuò)增方法，LAMP已被逐漸應(yīng)用于病原的分子檢測(cè)。LAMP技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些問題：(1)篩選特異性靶標(biāo)和設(shè)計(jì)引物是LAMP技術(shù)的關(guān)鍵，有些疾病的靶基因無法設(shè)計(jì)合適的引物，可能不適合LAMP方法；(2)LAMP方法的擴(kuò)增效率很高，在反應(yīng)過程中有大量的核酸合成，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染，加上目前國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不能嚴(yán)格分區(qū)，容易導(dǎo)致污染和出現(xiàn)反應(yīng)假陽性；(3)LAMP試劑相對(duì)于PCR試劑價(jià)格較貴。相信在未來的研究中LAMP將得到更多的改進(jìn)和完善，在寄生蟲病的快速分子檢測(cè)中發(fā)揮更大的作用。