合肥首例恙蟲(chóng)病病人血中東方體56 kDa外膜蛋白部分基因的擴(kuò)增及進(jìn)化分析*

操 敏 耿美玲 陳樂(lè)如 毛應(yīng)華譚偉龍 王長(zhǎng)軍 朱 進(jìn) 王忠燦

(南京軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心, 南京 210002)

恙蟲(chóng)病是東方體Orientiatsutsugamushi感染引起的蟲(chóng)媒自然疫源性疾病，以鼠類(lèi)為主要傳染源,通過(guò)恙螨幼蟲(chóng)叮咬而引起傳播。臨床上以發(fā)熱、焦痂或潰瘍、淋巴結(jié)腫大及皮疹為特征。1986年以來(lái)，我國(guó)恙蟲(chóng)病發(fā)病人數(shù)呈逐年增多態(tài)勢(shì)，每年發(fā)病數(shù)都在2 000例以上,恙蟲(chóng)病疫源地也逐步北移(吳光華，2000)。

恙蟲(chóng)病在安徽省屬新發(fā)傳染病。歷史上僅休寧1982年報(bào)告1例病例(胡成炎，1983), 接下來(lái)25年無(wú)病例報(bào)。但自2007年安徽三界駐軍部隊(duì)出現(xiàn)暴發(fā)流行以來(lái)(汪茂榮等,2008)，近幾年在阜陽(yáng)、蚌埠等地頻現(xiàn)恙蟲(chóng)病疫情(吳家兵等,2009)，提示安徽省可能廣泛存在恙蟲(chóng)病疫源地。本研究采用恙蟲(chóng)病膠體金診斷試劑對(duì)合肥一例不明發(fā)熱病人進(jìn)行快速診斷，對(duì)病人血DNA用恙蟲(chóng)病東方體特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行序列分析以鑒定其基因型別。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Invitrogen DNA 抽提試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司, TaKaRa EX Taq PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司,DNA 膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2 病例概況

男性,58歲,安徽肥東縣高亮鄉(xiāng)站馬村農(nóng)民,2011年11月11日因高燒39.5℃以上一周不退熱進(jìn)入安徽省立醫(yī)院就診。病人神志清醒，全身皮膚可見(jiàn)丘疹，呼吸粗重，頸部可見(jiàn)焦痂。給予頭孢曲松治療一周仍高燒不退，考慮可能是恙蟲(chóng)病，遂送血樣至本中心予以檢測(cè)。

1.3 病人血清恙蟲(chóng)病特異性抗體檢測(cè)

檢測(cè)總抗體的恙蟲(chóng)病膠體金診斷試劑為本中心研制,采用雙抗原夾心法檢測(cè)血樣中抗東方體總抗體(Caoetal.,2007)。檢測(cè)IgM和IgG的膠體金診斷試劑為本中心研制,采用間接法檢測(cè)血樣中的恙蟲(chóng)病特異性IgM 和IgG(Caoetal.,2007)。

1.4 病人血恙蟲(chóng)病東方體DNA 檢測(cè)

1.4.1血樣中DNA 的提取:采用Invitrogen DNA 抽提試劑盒，操作步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，0.5 mL 血樣提取的DNA 溶于200 μL ddH2O,-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2東方體56 kDa蛋白基因特異性引物： 根據(jù)恙蟲(chóng)病東方體標(biāo)準(zhǔn)株56 kDa蛋白基因序列(Stoveretal.,1990)設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為東方體P56-F：5′-CTCCAGGATTTAGAG CAGAG-3′，下游引物序列為OTP56-R：5′-CTAGAAGTTATAGCGTAC-3′。

1.4.3PCR 擴(kuò)增體系：PCR 擴(kuò)增體系為50 μL，采用TaKaRa EX Taq試劑盒，體系中含10×EX buffer(Mg+)5 μL, EX Taq 1 U,dNTP mixture 4 μL,血DNA 2 μL，上下游引物各10 pmol,補(bǔ)ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性5 min；94℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72℃ 1 min，35次循環(huán)；72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，成像系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果。

1.5 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

用Promega膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化，送至南京英駿公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果遞交GenBank。同時(shí)將其登錄NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行BLAST進(jìn)行序列比對(duì)同源性分析。用Bioedit 軟件將序列長(zhǎng)度編輯一致并進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換后, 用Clustal X 軟件與各地東方體分離株、標(biāo)準(zhǔn)株序列(表1)進(jìn)行多重排列、比較和同源性分析, 軟件Mega 4.0 中Distances 程序計(jì)算一組序列內(nèi)及組間基因進(jìn)化距離(Evolutionary distances), 利用最短進(jìn)化長(zhǎng)度算法(Minimal evolution) 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

表1 進(jìn)化樹(shù)分析所用的15個(gè)東方體株型及其56 kDa 蛋白基因的GenBank序列號(hào)Tab.1 The GenBank accession numbers of the 56 kDa protein genes of 15 strains of Orientia tustsugamshi used for phylogenetic tree analysis in this study

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測(cè)

采用恙蟲(chóng)病膠體金快速檢測(cè)試劑對(duì)病人血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果抗東方體總抗體及抗東方體IgM和IgG檢測(cè)線(xiàn)均出現(xiàn)紅色條帶(圖1)，為陽(yáng)性結(jié)果，表明病人存在東方體感染，并且為恙蟲(chóng)病現(xiàn)癥病人。予以強(qiáng)力霉素對(duì)癥治療，病人迅速退熱。

圖1 病人血清中抗東方體抗體檢測(cè)Fig.1 Detection of anti-O.tsutsugamushi antibodies in the serum of patient1:抗東方體總抗體檢測(cè); 2:抗東方體IgG和IgM檢測(cè).1:Detection of anti-O.tsutsugamushi total antibodies; 2: Detection of anti-O.tsutsugamushi IgG and IgM.

2.2 目的片段的擴(kuò)增

以東方體合肥株血樣基因組DNA為模板, 對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)測(cè)的目的基因分子量大小相符, 約1 320 bp。

圖2 PCR擴(kuò)增目的片段結(jié)果Fig.2 PCR amplification of the partial gene segment of O.tsutsugamushi 56 kDa proteinM: DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：PCR 產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照M: DNA marker;1: The PCR product of O.tsutsugamushi 56 kDa;2:Negative control.

2.3 生物信息學(xué)分析

將基因序列BLAST 顯示,測(cè)得合肥株?yáng)|方體56 kDa蛋白基因序列1 320 bp(JX976614)做BLAST序列比對(duì)，結(jié)果與昆明株和內(nèi)蒙古株的序列一致性為100%。進(jìn)化樹(shù)分析顯示該序列與昆明株和內(nèi)蒙古株在同一分支，與標(biāo)準(zhǔn)株Kuroki的親緣關(guān)系較近,共屬同一分支，進(jìn)化距離為0.015(圖3)。

圖3 15 株恙蟲(chóng)病東方體56 kDa基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of O. tsutsugamushi strains constructed based on nucleotide sequence of 56 kDaKarp, Gilliam, Kato, Kuroki, Kawasaki, Shimokoshi：標(biāo)準(zhǔn)株Standard strains of O. tsutsugamushi；Yonchon, Young worl：韓國(guó)分離株Strain from Korea；Ptan：中國(guó)平潭分離株Strain from Pingtan，China；Guangzhou中國(guó)廣州分離株Strain from Guangzhou，China；Kunming：中國(guó)昆明分離株Strain from Kunming，China；Inner Mongolia：中國(guó)內(nèi)蒙古分離株Strain from Inner Mongolia，China；Shandong：中國(guó)山東分離株Strain from Shandong，China；taiwan：中國(guó)臺(tái)灣分離株Strain from Taiwan，China.

3 討論

恙蟲(chóng)病廣泛流行于亞洲太平洋沿岸地區(qū)，我國(guó)屬于恙蟲(chóng)病重點(diǎn)疫區(qū)之一，疫區(qū)呈全國(guó)分布。安徽省近些年疫情頻現(xiàn)。2007年三界地區(qū)駐軍出現(xiàn)19例恙蟲(chóng)病病例(汪茂榮等,2008)；2008 年阜陽(yáng)出現(xiàn)恙蟲(chóng)病暴發(fā)流行病例78 例(吳家兵等,2009)； 同年, 蚌埠也出現(xiàn)數(shù)十例恙蟲(chóng)病病例；2009年, 阜陽(yáng)再次出現(xiàn)恙蟲(chóng)病暴發(fā)疫情(根據(jù)阜陽(yáng)縣疾控中心病例統(tǒng)計(jì))，提示安徽省廣泛存在恙蟲(chóng)病疫區(qū)。本次病例發(fā)生在安徽合肥市肥東縣高亮鄉(xiāng)站馬村，該地之前從未有恙蟲(chóng)病病例報(bào)告,屬合肥市范圍內(nèi)首次報(bào)告該病。病人發(fā)病前在家曾參加收割稻谷、稻草等農(nóng)活。據(jù)該病人家屬回顧憶當(dāng)?shù)嘏c該病人一起勞作的另一同齡農(nóng)民也出現(xiàn)相同癥狀，但未就醫(yī)。病人發(fā)病近期無(wú)外出史，推測(cè)當(dāng)?shù)乜赡転轫οx(chóng)病新疫區(qū),但尚需進(jìn)一步流行病學(xué)調(diào)查以證實(shí)疫源地存在。此次病例發(fā)生在11月初，為秋季型恙蟲(chóng)病，與既往安徽省報(bào)道恙蟲(chóng)病發(fā)病季節(jié)相同。

迄今, 世界各地已從患者、媒介昆蟲(chóng)及嚙齒動(dòng)物中分離到百余株恙蟲(chóng)病東方體(Daryletal.,2009)，我國(guó)各地恙蟲(chóng)病疫區(qū)已報(bào)道存在多種抗原型別的東方體(張萌等,2011)。東方體分型的傳統(tǒng)方法是血清學(xué)方法，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)，通過(guò)基因分型鑒定株型已得到廣泛的應(yīng)用。常用的方法是根據(jù)56 kDa型特異性蛋白基因分型, 所獲得關(guān)于遺傳多樣性、東方體系統(tǒng)發(fā)育的信息，對(duì)于確定抗原異質(zhì)性的寬幅以及建立特異診斷方法，制備有效疫苗分子具有重要作用(彭桂福等,2001； 陳香蕊等,1998)。

本研究從病人血中PCR擴(kuò)增出1 320 bp東方體56 kDa外膜蛋白部分基因， BLAST顯示該基因序列與昆明株和內(nèi)蒙古株相似度高，達(dá)100%。進(jìn)化樹(shù)分析顯示該序列與昆明株和內(nèi)蒙古株在同一分支，與分離自日本的標(biāo)準(zhǔn)株Kuroki親緣關(guān)系較近，進(jìn)化距離為0.015。目前安徽省已鑒定的東方體型別有阜陽(yáng)株Kawasaki型(圖3)，安徽三界株的Young whorl型(本課題組待發(fā)表論文)，提示安徽省存在多種東方體抗原基因型別。