紫竹PPO基因的生物信息學(xué)及表達(dá)分析

關(guān) 鷹，王 弋，郭小勤，林新春，方 偉

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）是一種能與Cu鏊合的膜結(jié)合蛋白，于1895年被發(fā)現(xiàn)，廣泛分布于動物、植物、真菌和細(xì)菌中[1]。多酚氧化酶有三種類型，分別為酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶。植物中，多酚氧化酶參與生物合成、光合作用、植物抗逆及褐化等過程[2]，尤其是在酶促褐變過程中，多酚氧化酶起關(guān)鍵作用[3]，它能作用于底物酚類物質(zhì)而引起材料的褐化[4]。近幾十年來，研究人員除了對多種植物的多酚氧化酶進(jìn)行研究外，還克隆了編碼基因，并對這些基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)情況及功能進(jìn)行了分析。

本實驗從紫竹（Phyllostachys nigra）栽培類型一年紫中克隆了該基因的片段，對其序列分析顯示，該序列與此前從臺灣紫竹中獲得的另一個同源基因片段有一定的差異，顯示出該基因在不同栽培類型中具多態(tài)性。組織特異性分析結(jié)果顯示，該基因在一年紫幼嫩部位的表達(dá)量高于其他成熟組織。

1 材料與方法

1.1 材料

在浙江農(nóng)林大學(xué)翠竹園采集一年生紫竹的幼嫩葉片，采用CTAB法提取基因組DNA，－20℃保存?zhèn)溆?。在同一株上采集莖、筍尖、全筍、鞭根、葉芽，采用Trizol法提取其總RNA，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 紫竹PnPPO1基因片段的克隆

利用Primer軟件參照GeneBank上所登錄的PPO基因保守序列設(shè)計兼并引物，PnPPO1上游引物：5'-TTCGCGCTGCCGTTCTGGAA-3'，下游引物：5'-GATGTGCCACATGCGGTCGA-3'。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：10×PCR buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，上游引物（10 μmol/L）2 μL，下游引物（10 μmol/L）2 μL，Taq DNA聚合酶 0.15 μL，模板DNA 1.0 μL（100 ng），ddH2O 12.45 μL。PnPPO1反應(yīng)程序為：94℃：3 min，94℃：30 s，50℃：30 s，72℃：1 min，38個循環(huán)，72℃：5 min，4℃保溫。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。用鼎國XA014-1膠回收試劑盒對目的片段進(jìn)行割膠回收，連接到pMD20-T載體（大連寶生物公司），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受細(xì)胞DH5α，挑取白斑，提取質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切檢測，確定結(jié)果正確后進(jìn)行測序。

1.3 紫竹PnPPO1基因的組織特異性表達(dá)分析

以所提取的莖，筍尖，全筍，鞭根，葉芽的總RNA為材料，參照試劑說明書分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用半定量PCR法對紫竹上述部位PnPPO1基因的表達(dá)進(jìn)行分析。以β-actin基因為內(nèi)標(biāo)。β-actin反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，27個循環(huán)，72℃延伸5 min。PnPPO1反應(yīng)程序如上，循環(huán)數(shù)為28循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PnPPO1基因片段的克隆及序列分析

以紫竹一年紫嫩葉 cDNA為模板，以PnPO1引物進(jìn)行擴增，將擴增產(chǎn)物回收，轉(zhuǎn)化，測序，測序結(jié)果顯示該片段長438 bp，核苷酸序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列為PPO同源基因，該基因與水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestiv）、蓮（Nelumbo nucifera）、荔枝（Litchi chinensis）、玉米（Zea mays）等植物的PPO基因序列有很高的同源性，其中與小麥的同源性達(dá)到 75%，故將其命名為PnPPO1。DNAMAN分析顯示，該片段編碼146個氨基酸（圖1），蛋白分子量約為36.2 kD，等電點為5.03。Blastp結(jié)果顯示，該蛋白屬于酪氨酸酶（圖2），具有PPO蛋白典型的特征，含有1個保守的CuB結(jié)合區(qū)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在該區(qū)域有4個保守的H（His）和一個F（Phe）（圖1）。

圖1 PnPPO1 cDNA及氨基酸序列Figure1 cDNA and amino acid sequence of PnPPO1

圖2 PnPPO1基因編碼的部分氨基酸序列的比對結(jié)果Figure2 The blastp of PnPPO1partial amino acid sequence

利用ProtParam對PnPPO1氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行在線預(yù)測，該氨基酸序列不穩(wěn)定指數(shù)較高（表1）。利用TMHMM2.0在線預(yù)測了PnPPO1的跨膜情況，結(jié)果顯示，PnPPO1蛋白在該區(qū)段沒有發(fā)現(xiàn)跨膜位點并且膜外概率高于膜內(nèi)，PPO蛋白有可能是一個膜外蛋白（圖3）。

表1 一年紫PnPPO1氨基酸殘基理化性質(zhì)分析Table1 Physio-chemical characteristics analysis of PnPPO1 amino acids

運用ProtScale對PnPPO1的氨基酸殘基進(jìn)行疏水性分析顯示，總體上親水氨基酸明顯多于疏水氨基酸（圖4），說明一年紫PnPPO1蛋白在該區(qū)域顯示較高的親水性。

另外，所擴增到的該氨基酸片段具有α-螺旋（含量10.28%），β-折疊（4.79%）且α-螺旋串通不同長度的無規(guī)則卷曲（84.93%）。

對從一年紫和臺灣紫中獲得兩條PPO序列進(jìn)行分析，比對結(jié)果顯示，兩者同源性為86.45%，兩序列間除了片段缺失外，還存在明顯的 SNP位點，多態(tài)性頻率為 1 SNP/27.3bp，其中以A/G轉(zhuǎn)換類型最多，占81.25%。由于單堿基的變異，一年紫和臺灣紫中酶切位點也會發(fā)生變化，從圖4中可以看出，由于單核苷酸的變異，有6處酶切位點發(fā)生了變化，其中5處為新酶切位點的產(chǎn)生，1處表現(xiàn)為酶切位點的變換（圖5）。

圖3 一年紫PnPPO1跨膜預(yù)測Figure3 Predicted transmembrane of PnPP01

2.2 PnPPO1基因的組織特異性表達(dá)

為研究PnPPO1基因在一年紫不同組織部位中的表達(dá)情況，以β-actin基因為對照，對PnPPO1進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果如圖6。由圖6可知，在所檢測的5個組織中，該基因在葉芽中的表達(dá)量最高，在鞭根中微量表達(dá)，而在其余的組織未檢測到其表達(dá)。

圖4 一年紫PnPPO1基因保守區(qū)推斷的氨基酸序列疏水圖Figure4 Hydrophobic analysis of on amino acids in the PnPPO1 sequence

圖5 一年紫PnPPO1與臺灣紫PnPPO的序列比對Figure5 Alignment sequence between PnPPO1and PnPPO1

圖6 PnPPO1的組織特異性表達(dá)Figure6 Expression pattern of PnPPO1

3 結(jié)論與討論

本研究利用同源克隆技術(shù)從一年紫嫩葉中獲得PnPPO1的cDNA序列，與之前從臺灣紫中獲得的序列的同源性為 86.45%，兩序列間除了堿基缺失外，還存在有豐富的SNP位點，且以A/G型轉(zhuǎn)換位點最豐富。研究表明，PPO蛋白具有3個Cu結(jié)合區(qū)域（CuA、CuB、CuC），CuA與PPO的水溶性有關(guān)，CuB是底物結(jié)合的最關(guān)鍵區(qū)域，CuC與分子氧相連且調(diào)節(jié)葉綠體中有害光氧化反應(yīng)，參與電子傳遞，起能量轉(zhuǎn)換作用[5]。在實驗獲得的146個氨基酸殘基中存在有CuB區(qū)域，該區(qū)域包含有保守的5個H（His），一個F（Phe），二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，本實驗中所獲得的一年紫PnPPO1蛋白片段中含2個α-螺旋（含量10.27%），1個β-折疊（4.79%）串通不同長度的無規(guī)則卷曲（84.93%）。

PPO是一種質(zhì)體酶，它在植物中的分布有兩個特點：一是常存在于光合組織和非光合質(zhì)體中，二是在植物的幼嫩部分含量比較高[6]。研究表明，在不同物種、組織和發(fā)育階段，PPO的表達(dá)水平存在較大差異[7]，如番茄中，該基因僅在葉片發(fā)育后期的柵欄細(xì)胞中表達(dá)，而蛋白主要存在于嫩葉、花、根形態(tài)建成等時期的表皮細(xì)胞中，隨著葉片的發(fā)育成熟，幾乎檢測不到該蛋白的存在[8]。在馬鈴薯中，該基因僅在頂端的四個葉節(jié)點上能檢測到表達(dá)，而其蛋白存在于所有的葉節(jié)點上。在蓮藕中，該基因在整個供試組織中都有表達(dá)，但在莖尖和幼葉中表達(dá)量最高，其次為新鮮的蓮藕切片，而在花瓣和莖稈中表達(dá)量最低[9]。本研究結(jié)果表明，一年紫中PnPPO1在葉芽中表達(dá)量最高，在鞭根中微量表達(dá)，而在其余組織中未檢測表達(dá)，推測PnPPO1先在葉芽中表達(dá)，然后再分配到各組織中，在特定的時空下被激活并擔(dān)負(fù)相應(yīng)的功能。

致謝：感謝浙江農(nóng)林大學(xué)特聘教授鄭康樂在實驗和論文寫作中提出的寶貴建議和意見。

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