香榧體細(xì)胞胚發(fā)生的初步研究

姚 進(jìn)，黃堅欽，胡恒康，裘林艷，朱旻華，張啟香

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安311300；2.上海園林綠化建設(shè)有限公司，上海 200333；3.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300)

香榧Torreya grandis‘Merrillii’是實生榧樹Torreya grandis的優(yōu)良變異類型或優(yōu)株經(jīng)人工嫁接繁殖而成的的優(yōu)良品種[1]，為中國特有的珍稀干果樹種，經(jīng)濟(jì)壽命長，栽培效益高，具有巨大的發(fā)展?jié)摿2]。長期以來，香榧的繁殖主要通過嫁接等方法進(jìn)行，繁殖技術(shù)落后，繁殖系數(shù)低，嚴(yán)重制約了香榧的大規(guī)模栽培，因此，開展香榧離體快繁技術(shù)的研究對推動香榧產(chǎn)業(yè)擺脫發(fā)展瓶頸，提升產(chǎn)業(yè)規(guī)模具有重要意義。關(guān)于香榧離體快繁的研究僅國內(nèi)有報道，至今尚未建立高效、穩(wěn)定的再生體系。2004年姜新兵等[3]首次報道了香榧體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究，但僅停留在體胚的增殖階段；劉海琳等[4]以香榧莖段為外值體，通過器官發(fā)生途徑，獲得了再生植株；金航標(biāo)等[5]對香榧腋芽組培及嫩枝嫁接技術(shù)進(jìn)行了初步研究。本試驗以香榧胚為外植體，研究了基本培養(yǎng)基、復(fù)合添加物、碳源和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對香榧胚性愈合組織(callus)誘導(dǎo)的影響，篩選出胚性愈合組織誘導(dǎo)與增殖的適宜培養(yǎng)條件，初步進(jìn)行了體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)與萌發(fā)試驗，為進(jìn)一步建立高效、穩(wěn)定的香榧體胚發(fā)生和遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與外植體處理

香榧種子(圖1-1)采自浙江省富陽市洞橋鎮(zhèn)55年生香榧樹上，去除假種皮后，用洗滌劑漂洗干凈，自來水沖洗3～4 h。超凈工作臺上用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇表面滅菌3 min，無菌水沖洗3～4次，稀釋10倍的次氯酸鈉溶液(50 mL加1滴吐溫)真空抽濾20 min，無菌水沖洗5～6次。表面滅菌后的種子用剪刀剪去外種皮，顯微鏡下剝?nèi)⊥暾?胚處于早期心形胚階段，圖1-2)，接入相應(yīng)培養(yǎng)基。

1.2 愈合組織誘導(dǎo)

1.2.1 基本培養(yǎng)基和復(fù)合添加物 在基本培養(yǎng)基 MS(Murashige-Skoog)[6]，SH(Schenk and Hildebrandt)[7]和 B5(Gamborg 等)[8]中分別添加不同種類復(fù)合添加物谷氨酰胺(Gln)，水解酪蛋白(CH)和肌醇，各 500 mg°L－1，并設(shè)置基本培養(yǎng)基空白對照，共12個處理。各個處理均附加0.10 mg°L－16-芐氨基腺嘌呤(6-BA)，0.50 mg°L－12，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，30 g°L－1蔗糖，9.5 g°L－1瓊脂，pH 5.7，暗培養(yǎng)。接種幼胚20個°處理－1，重復(fù) 3 次。

1.2.2 碳源及其質(zhì)量濃度 研究不同質(zhì)量濃度(20，30，45 g°L－1)葡萄糖、蔗糖和麥芽糖組成的9個處理對香榧愈合組織形成的影響?；九囵B(yǎng)條件為 SH+0.10 mg°L－16-BA+0.50 mg°L－12，4-D+9.5 g°L－1瓊脂，pH 5.7，暗培養(yǎng)。接種20個胚°處理-1，重復(fù)3次。

1.2.3 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 研究不同質(zhì)量濃度6-BA(0，0.10，0.50，1.00 mg°L－1)，細(xì)胞激動素KT (0，0.10，0.50，1.00 mg°L－1)，2，4-D(0，0.10，0.50，1.00，2.00 mg°L－1)組合以及 6-BA(0，0.10，0.50，1.00 mg°L－1)，KT(0，0.10，0.50，1.00 mg°L－1)，NAA(0.10，0.50，1.00，2.00 mg°L－1)組合，共 32 個處理對香榧愈合組織形成的影響。基本培養(yǎng)條件為SH＋30 g°L－1蔗糖＋9.5 g°L－1瓊脂，pH 5.7，暗培養(yǎng)。接20個胚°處理-1，重復(fù)3次。

圖1 香榧體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)與萌發(fā)Figure 1 Somatic embryogenesis of Torreya grandis ‘Merrillii’

1.3 胚性愈合組織形成和增殖

選擇生長勢基本一致的愈合組織轉(zhuǎn)入到較佳的胚性愈合組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)減少為1/2，4周繼代1次。胚性愈合的增殖試驗中，先將胚性愈合組織在待試驗處理中培養(yǎng)4周，統(tǒng)計第2次繼代的增殖情況，30管°處理-1，重復(fù)3次。

1.4 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)與萌發(fā)

以SH為基本培養(yǎng)基，添加ABA和PEG 6000，初步進(jìn)行了體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)試驗，獲得的體胚在1/2SH基本培養(yǎng)基上萌發(fā)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

胚接種4周，在體視顯微鏡下觀察其生長狀況，統(tǒng)計各個處理的愈合組織形成率和褐化率。胚性愈合組織增殖試驗接入4周后稱量；接入的胚性愈合組織質(zhì)量為G0=G2－G1，增殖4周的胚性愈合組織質(zhì)量為G3=G5－G4；式中G1為培養(yǎng)基與試管的質(zhì)量，G2為接入胚性愈合組織后試管的質(zhì)量。G5為增殖后胚性愈合與試管的質(zhì)量，G4為取出胚性愈合后的試管質(zhì)量。實驗數(shù)據(jù)采用SigmaPlot 8.0和SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，Duncan氏新復(fù)極差檢驗法進(jìn)行多重比較。

愈合組織形成率(%)=(各個處理中形成愈合組織的外植體總數(shù)/各個處理中未污染的外植體總數(shù))×100%；褐化率(%)=(各個處理褐化的外植體總數(shù)/各個處理中未污染的外植體總數(shù))×100%；胚性愈合組織增殖倍數(shù)=G3/G0。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈合組織誘導(dǎo)

2.1.1 基本培養(yǎng)基和復(fù)合添加物對愈合組織形成的影響 香榧胚接種到相應(yīng)培養(yǎng)基上，大部分脫分化形成愈合組織或萌發(fā)產(chǎn)生子葉肥厚的畸形苗，少數(shù)胚褐化。幼胚一般2周左右開始膨大(圖1-3)，4周左右可見明顯的愈合組織。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):誘導(dǎo)的愈合組織大致可分為2類:水漬狀愈合組織和疏松狀愈合組織。方差分析和多重比較結(jié)果(圖2)表明:不同處理中外植體愈合組織形成率和褐化率存在顯著性差異(P＜0.05)。基本培養(yǎng)基對愈合組織形成率的影響大于復(fù)合添加物。SH，MS和B5等3組試驗中，平均褐化率依次為MS＞B5＞SH，平均愈合組織形成率依次為SH＞MS＞B5。試驗的12個處理中，SH+Gln的愈合形成率最高，為50.8%。在SH和MS中添加500 mg°L－1Gln，有利于降低褐化率，提高愈合組織形成率，但形成的愈合組織多呈水漬狀，增殖速度慢且容易褐化。SH+肌醇和SH+CH處理的愈合組織形成率雖略低于SH對照處理，但其誘導(dǎo)的疏松愈合組織比例高，生長勢旺盛。

2.1.2 不同碳源對愈合組織形成的影響 不同碳源種類和質(zhì)量濃度對香榧愈合組織形成的影響(圖3)存在顯著差異 (P＜0.05)。添加蔗糖組的形成率明顯高于葡萄糖組和麥芽糖組，蔗糖組和麥芽糖組產(chǎn)生的愈合組織多為金黃色疏松，偶有乳白色愈合組織，葡萄糖組水漬狀愈合組織比例較高。3種碳源不同質(zhì)量濃度間的愈合組織形成率，隨著質(zhì)量濃度的升高而降低，當(dāng)蔗糖的質(zhì)量濃度為20 g°L－1時愈合形成率最高，達(dá)51.3%；質(zhì)量濃度為30 g°L－1，愈合組織形成率為47.5%，可能由于碳源量充足，愈合組織生長量比 20 g°L－1高。

2.1.3 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對愈合誘導(dǎo)的影響 以SH為基本培養(yǎng)基，6-BA，KT，2，4-D等3種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)不同質(zhì)量濃度配比均能誘導(dǎo)形成愈合組織。方差分析與多重比較結(jié)果(表1)顯示:各處理的愈合組織形成率和褐化率差異性顯著(P＜0.05)。培養(yǎng)基中不添加6-BA時，隨著2，4-D濃度的升高，愈合組織誘導(dǎo)率逐漸下降，疏松愈合組織數(shù)也依次減少，0.10 mg°L－12，4-D的愈合組織誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率為52.1%。當(dāng)2，4-D為0.50 mg°L－1，愈合組織誘導(dǎo)率隨BA質(zhì)量濃度的升高而下降。添加1.00 mg°L－1的KT，能降低褐化率。從表1和表2的結(jié)果來看，以SH為基本培養(yǎng)基，單獨添加低質(zhì)量濃度的NAA或 2，4-D對愈合組織形成有促進(jìn)作用，低質(zhì)量濃度的NAA比低質(zhì)量濃度的2，4-D效果好。表3中6-BA，KT和NAA不同質(zhì)量濃度水平的愈合組織誘導(dǎo)率和褐化率差異性顯著(P＜0.05)。隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高平均愈合組織誘導(dǎo)率逐漸降低，培養(yǎng)基中不添加6-BA時，愈合組織平均誘導(dǎo)率最高。0.10 mg°L－1NAA處理的誘導(dǎo)率最高，為60.1%，且大部分愈合呈疏松狀。4組6-BA處理的外植體褐化率隨著KT質(zhì)量濃度的升高呈先升高后降低趨勢，在6-BA為0.10 mg°L－1，并添加0.10 mg-L－1KT和0.10 mg°L－1NAA的培養(yǎng)基上，褐化率最低，僅為2.4%。試驗中還發(fā)現(xiàn)當(dāng)6-BA和NAA質(zhì)量濃度均較高時，幼胚多萌發(fā)產(chǎn)生子葉肥厚的畸形苗。

圖2 基本培養(yǎng)基和復(fù)合添加物對香榧愈合組織形成的影響Figure 2 Effect of basal media and composite additives on callus formation of Torreya grandis ‘Merrillii’

圖3 不同碳源對香榧愈合組織形成的影響Figure 3 Effect of carbon sources on callus formation of Torreya grandis ‘Merrillii’

表1 6-BA，KT和2，4-D對香榧愈合組織形成的影響Table 1 Effect of 6-BA，KT and 2，4-D on callus formation of Torreya grandis ‘Merrillii’

2.2 胚性愈合組織的形成和增殖

2.2.1 胚性愈合組織的形成 篩選生長勢基本一致的愈合組織分別轉(zhuǎn)入到較佳的愈合組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)減少為 1/2，即 SH+0.05 mg°L－16-BA+0.25 mg°L－12，4-D，SH+0.05 mg°L－12，4-D，SH+0.05 mg°L－1NAA。水漬狀愈合組織接種1周后即褐化，幾乎停止生長，只有疏松狀愈合組織能繼續(xù)增殖(圖1-4)。疏松狀愈合組織在SH+0.05 mg°L－1NAA培養(yǎng)基上，3周左右開始產(chǎn)生乳白色半透明的胚性愈合組織(圖1-5)，并能大量增殖(圖1-6)。疏松狀愈合組織在 SH+0.05 mg°L－16-BA+0.25 mg°L－12，4-D，SH+0.05 mg°L－12，4-D培養(yǎng)基上生長緩慢，易發(fā)生褐化，需要2～3次的繼代，增殖速度才開始加快。繼代過程中 SH+0.05 mg°L－12，4-D 培養(yǎng)基上能產(chǎn)生乳白色愈合組織，而 SH+0.05 mg°L－16-BA+0.25 mg°L－12，4-D 培養(yǎng)基上多形成淡黃色顆粒狀愈合組織。

表2 6-BA，KT和NAA對香榧愈合組織形成的影響Table 2 Effect of 6-BA，KT and NAA on callus formation of Torreya grandis ‘Merrillii’

2.2.2 胚性愈合組織的增殖 為了獲得適宜的胚性愈合組織增殖培養(yǎng)基，根據(jù)前期愈合組織誘導(dǎo)效果篩選了5個處理進(jìn)行了篩選試驗。結(jié)果(表3)表明:以4周作為1個繼代周期，不同處理間的增殖倍數(shù)存在顯著差異(P＜0.05)。SH基本培養(yǎng)基的增殖倍數(shù)最大，達(dá)9.7，但易出現(xiàn)玻璃化。SH+0.05 mg°L－1NAA的增殖效果最好，而且多次繼代后，胚性培養(yǎng)物仍呈乳白色、透明狀。胚性愈合組織在SH+0.05 mg°L－1KT+0.25 mg°L－1NAA 上繼代后多產(chǎn)生乳白色黏稠愈合組織。在 SH+0.05 mg°L－16-BA+0.10 mg°L－12，4-D 培養(yǎng)基上胚性愈合組織增殖過程中易失去胚性，表現(xiàn)為褐化或黃色黏稠狀。

表3 胚性愈合組織的增殖結(jié)果比較Table 3 Effect of plant growth regulators on embryogenic tissue proliferation

2.3 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)與萌發(fā)

初步的實驗結(jié)果表明:在添加ABA和PEG6000的SH培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3周，胚性愈合組織能產(chǎn)生體胚(圖1-7)，實驗的3個處理中，5 mg°L－1ABA+10 g°L－1PEG 6000培養(yǎng)基上形成的體胚數(shù)最多且畸形體胚比例較小。體胚在弱光(1 200 lx)下(圖1-9)的萌發(fā)效果比黑暗條件(圖1-8)下好。部分體胚在1/2SH基本培養(yǎng)基上萌發(fā)，子葉展開良好，但部分體胚發(fā)育至早期胚時期便開始脫分化，形成畸形體胚。

3 結(jié)論與討論

香榧幼胚接入不同培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)形成的愈合組織大致可分為水漬狀愈合和疏松狀愈合2類。水質(zhì)狀愈合組織易褐化，幾乎不生長，只有疏松狀愈合組織能繼續(xù)增殖。香榧幼胚愈合組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基應(yīng)選擇SH為宜，碳源以蔗糖最好。于大德等[9]指出，添加Gln作為氮源可有效提高云南松Pinus yunnanensis成熟合子胚的愈合組織誘導(dǎo)率并減少褐化比例。本研究中也發(fā)現(xiàn)在SH和MS中添加500 mg°L－1Gln，有利于降低褐化率，提高愈合組織誘導(dǎo)率，但誘導(dǎo)的愈合組織多呈水漬狀，且容易褐化。SH+肌醇和SH+CH等2個處理誘導(dǎo)的愈合組織質(zhì)量雖較高，但愈合組織形成率卻低于SH對照處理。可見，Gln，肌醇和CH對幼胚愈合組織發(fā)生的誘導(dǎo)效果不明顯。

不同發(fā)育階段的外植體由于生理狀態(tài)不一樣，會對相同的培養(yǎng)條件產(chǎn)生不同反應(yīng)[10－11]，針葉樹種合子胚的發(fā)育階段，是影響其愈合組織形成的關(guān)鍵因素[12－14]。姜新兵等[3]曾報道在 SH+0.1 mg°L－16-BA+0.5 mg°L－12，4-D 培養(yǎng)基上，胚的愈合誘導(dǎo)率可達(dá) 69.8%。本研究發(fā)現(xiàn)，SH+0.1 mg°L－1BA+0.5 mg°L－12，4-D培養(yǎng)基上的愈合誘導(dǎo)率均在50%以下，可能是由外植體的采集時期不同引起。高質(zhì)量濃度的2，4-D，BA和KT組合對多數(shù)針葉樹種合子胚快速誘導(dǎo)形成愈合組織有利；冷杉Abies fabri屬樹種的胚發(fā)生培養(yǎng)物也可在只含細(xì)胞分裂素而無任何生長素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生[15]，而NAA激素組合比2，4-D組合更有利于東北紅豆杉Taxus cuspidata的愈合組織誘導(dǎo)[16]。本研究中，NAA或2，4-D與其他生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的組合使用，愈合組織誘導(dǎo)效果不明顯，低質(zhì)量濃度NAA或2，4-D單獨使用促進(jìn)愈合組織發(fā)生，尤以低質(zhì)量濃度NAA的效果最好，當(dāng)NAA為0.1 mg°L－1時，愈合組織形成率達(dá)60.1%。

2，4-D在植物胚性愈合組織的誘導(dǎo)中起著重要作用[17]，松柏類植物胚性組織誘導(dǎo)一般需要添加2，4-D，但在胚性組織增殖階段，應(yīng)該及時去掉或降低2，4-D質(zhì)量濃度[18]。華北落葉松Larix principis-rupprechtii胚性愈合組織長期在含有高質(zhì)量濃度2，4-D的培養(yǎng)基上繼代，會導(dǎo)致體細(xì)胞胚成熟能力的喪失，用NAA代替2，4-D明顯提高了成熟胚的質(zhì)量[19]。香榧胚性愈合組織的誘導(dǎo)必須去掉2，4-D[20]。本試驗中，2，4-D不利于胚性愈合組織的形成和增殖，SH+0.05 mg°L－1NAA是胚性愈合組織形成和增殖最理想培養(yǎng)條件。

體細(xì)胞胚的成熟和萌發(fā)是多數(shù)木本植物建立體細(xì)胞胚再生體系時的主要難題[21]。姜新兵等[3]首次獲得了香榧體細(xì)胞胚，但未提及體胚成熟和萌發(fā)問題。本研究發(fā)現(xiàn)，香榧的體胚發(fā)生有一定難度，次生胚發(fā)生率較高，一定程度上抑制了體胚的成熟，在1/2SH基本培養(yǎng)基上部分體胚發(fā)育至早期胚時期便開始脫分化，形成畸形體胚，僅少量體胚萌發(fā)，子葉展開良好。因此，仍需加強(qiáng)對體胚誘導(dǎo)、成熟和萌發(fā)條件的系統(tǒng)研究，為建立高效穩(wěn)定的香榧體胚發(fā)生和遺傳轉(zhuǎn)化體系鋪平道路。

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