王冬梅,呂振江,王永紅,張春孫
(1.西北農(nóng)林科技大學 林學院,陜西 楊凌 712100;2.上海睿智化學研究有限公司,上海 201203)
玉竹Ploygonatum odoratum為百合科Liliaceae黃精屬Ploygonatum多年生草本植物,以干燥根莖入藥[1-2]。玉竹是中國的傳統(tǒng)中草藥,且可藥食兩用。該藥性甘,微寒,能養(yǎng)陰潤肺,益胃生津,用于燥熱、傷陰、熱傷胃陰之癥[3-4]。藥理研究表明,玉竹能增強免疫力,煎劑有擴張血管、抗急性心肌缺血、降壓、抗衰老、抗菌作用,注射液有降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[5-6]。玉竹的藥理作用與其多種活性成分有密切關(guān)系。糖類是玉竹的主要成分,其次是黃酮類化合物和甾體皂苷[7-9]。目前,國內(nèi)外對玉竹的研究主要集中在化學成分、藥理作用、臨床療效等方面,而對玉竹的炮制方法、炮制工藝及飲片的質(zhì)量標準鮮有研究。玉竹為傳統(tǒng)中藥,臨床需炮制后方可入藥[10]。玉竹干條、干片(飲片)也是玉竹進入藥材市場的主要方式[11]。《中華人民共和國藥典》所頒布的玉竹炮制規(guī)范中僅涉及其除雜、水洗,潤透,切厚片或段,干燥等工藝,而且對具體的工藝參數(shù)沒有規(guī)范,另外,目前對玉竹生品加工的研究主要是關(guān)于藥材干燥方法和去皮、切片等處理[12-14]。由于不同操作的人有不同的經(jīng)驗,所得產(chǎn)品很難一致,甚至存在誤傳誤用,嚴重影響了中藥的療效。陳勝璜等[15]研究表明,玉竹的炮制方法主要有蒸法(清蒸、酒蒸、和蜜蒸)和炒法(清炒、蜜炒)2類,蒸法優(yōu)于炒法,但卻未說明具體的蒸制影響因素。作者在前期研究中已對玉竹蜜蒸炮制工藝進行了研究,確定了玉竹蜜蒸炮制的最優(yōu)條件,但卻沒有對玉竹酒蒸工藝進行進一步的深入研究和比較,因此,為了進一步確定玉竹炮制的最佳方法和工藝條件,本研究以多糖、皂苷、黃酮、醇提物、水溶物和水分等6個指標為評價標準,以6種成分的抗氧化活性和含量為基礎,采用多指標綜合評分法及正交試驗優(yōu)化了玉竹的酒蒸炮制工藝,以期為改善玉竹炮制品的質(zhì)量,提升玉竹在藥用或保健食品等方面的應用價值提供基礎理論依據(jù)。
1.1.1 試驗材料 玉竹根莖于2010年10月采自秦嶺太白山厚畛子。樣品由西北農(nóng)林科技大學林學院李登武教授鑒定,切成薄片,自然干燥后備用。
1.1.2 儀器與試劑 TU1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);JA5003型分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司);R-GG17型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);SHB-Ⅱ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);101-1型電熱恒溫鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司);HHSY2-N18型電熱恒溫水浴鍋(哈爾濱東聯(lián)公司)。無水葡萄糖(廣東光華化學廠有限公司,批號20100508),薯蕷皂苷元(中國藥品生物制品檢定所,批號111539-20000),蘆丁(中國藥品生物制品檢定所,批號100080-200707),黃酒(乙醇體積分數(shù)為 14.5%,總糖以葡萄糖計≤15.0 g·L-1)。苯酚、濃硫酸、高氯酸、甲醇、無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、三氯化鋁均為分析純。
1.2.1 實驗設計 玉竹酒蒸工藝中有4個關(guān)鍵因素:酒潤時間、黃酒用量、蒸制時間和蒸制溫度。每個因素根據(jù)實際生產(chǎn)選定5個水平進行單因素實驗。根據(jù)單因素實驗結(jié)果,再選定3個因素和3個水平進行正交實驗(表1)。
表1 試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of factor experiential
1.2.2 樣品的炮制 稱取玉竹藥材60.00 g,置于適宜容器內(nèi),依據(jù)表1設計的炮制條件進行炮制。先用定量的黃酒(A)拌勻,悶潤(D)至黃酒被吸盡后,再按蒸制時間(B)和蒸制溫度(C)進行炮制。60℃干燥4 d后,測定炮制品中各指標(表2)。
表2 指標權(quán)重Table 2 Weight of index
1.2.3 多糖測定[16-17]①標準曲線的制備。精密稱取無水葡萄糖標準品60.0 mg,用蒸餾水溶解定容至100.0 mL。分別精密吸取1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5 mL上述標準液并定容至 50.0 mL。分別吸取2.0 mL上述溶液置試管中,加入1.0 mL體積分數(shù)為5%苯酚,7.0 mL濃硫酸,搖勻,靜置5 min,沸水浴加熱15 min,置冰水浴5 min。另吸取2.0 mL蒸餾水重復上述操作,做空白對照。在波長490 nm處測吸光度。以質(zhì)量(mg)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=5.733 33x+0.032 4(r=0.999 6,線性范圍0.024~0.120 mg)。②樣品中多糖測定。稱取玉竹樣品2.00 g,加水200.0 mL,浸泡12.0 h,80℃回流1.5 h,提取1次,合并濾液,濃縮至5.0 mL,加無水乙醇至醇體積分數(shù)為95%,加入1.0 mol·L-1氫氧化鈉,調(diào)節(jié)酸堿度至pH 7,靜置12.0 h,過濾,將濾渣于60℃下鼓風烘干即得多糖精制品。取多糖精制品25.0 mg,加水溶解并定容至50.0 mL,吸取3.0 mL加水定容至50.0 mL,得樣品溶液。吸取樣品溶液2.0 mL,按標準曲線制備的方法操作,顯色,測定,計算多糖。
1.2.4 皂苷測定[18]①標準曲線的制備。精密稱取3.0 mg薯蕷皂苷元,用甲醇溶解并定容至10.0 mL,精密移取0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8 mL上述溶液,用高氯酸定容至10.0 mL,旋渦混勻1 min后置70℃水浴中加熱15 min,立即置于冰水浴中5 min以停止反應,以高氯酸為空白對照,在波長408 nm處測定吸光度。以質(zhì)量(mg)為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=3.549 8x+0.077 0(r=0.999 9,線性范圍0.060~0.240 mg)。②樣品中皂苷測定。稱取玉竹樣品 5.00 g,加60.0 mL石油醚脫脂2.0 h,加入45.0 mL體積分數(shù)為70%乙醇浸泡12.0 h,80℃水浴中回流提取2次,1.5 h·次-1,合并濾液,濃縮至干。50.0 mL蒸餾水溶解,用正丁醇萃取3次,合并萃取液,濃縮至干即得皂苷粗品。用甲醇溶解皂苷粗品并定容至50.0 mL,取溶液0.5 mL,按標準曲線制備的方法操作,測吸光度,根據(jù)回歸方程計算樣品中皂苷。
1.2.5 黃酮測定[19]①標準曲線的制備。精密稱取4.00 mg蘆丁對照品,用體積分數(shù)為60%乙醇溶解并定容至100.0 mL容量瓶中,即得對照品溶液。分別移取1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mL對照品溶液于 25.0 mL 容量瓶中,加入 1.0 mL 0.50 mol·L-1亞硝酸鈉(NaNO2),靜置 5 min 后加 1.0 mL 0.30 mol·L-1氯化鋁(AlCl3)溶液,搖勻,5 min后加入5.0 mL 1.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液,用體積分數(shù)為60%乙醇定容至刻度,空白對照用體積分數(shù)為60%乙醇代替對照品溶液,在525 nm波長處測吸光度。以質(zhì)量(mg)為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=0.500 01x-0.003 4(r=0.999 3,線性范圍0.040~0.400 mg)。②樣品中黃酮含量的測定。稱取玉竹樣品5.00 g,加60.0 mL體積分數(shù)為70%的乙醇,浸泡1.0 h,在80℃水浴中回流提取2次,2.0 h·次-1,合并濾液,定容至250.0 mL。吸取溶液5.0 mL,按標準曲線制備的方法操作,測吸光度,根據(jù)回歸方程計算樣品中黃酮。
1.2.6 水分測定 將各酒蒸玉竹樣品冷卻至室溫后,精密稱取1.00 g,60℃下烘干至恒質(zhì)量后,計算水分含量。
1.2.7 水溶物測定 稱取酒蒸玉竹樣品2.00 g于錐形瓶中,加水50.0 mL,靜置1.0 h后,80℃水浴回流1.0 h,過濾,濾液減壓濃縮至干,稱量,計算水溶物。
1.2.8 醇溶物測定度 稱取酒蒸玉竹樣品2.00 g于錐形瓶中,加50.0 mL無水乙醇,靜置1.0 h后,80℃水浴回流1.0 h,過濾,濾液減壓濃縮至干,稱量,計算醇溶物。
1.2.9 層次分析法[20-21]①層次分析法的基本思路。通過將復雜問題分解為若干層次或若干要素,并在同一層次各要素之間簡單地進行比較、判斷和計算,即可以得出不同方案的重要度,從而為選擇最佳方案提供決策依據(jù)。②權(quán)重系數(shù)的確定。根據(jù)層次分析法原理,以多糖、皂苷、黃酮、醇溶物、水溶物和水分6個指標為評價標準,以6種成分的抗氧化活性和含量為基礎[22-24],反應玉竹酒蒸工藝的總評價目標,建立評價目標樹,確定權(quán)重系數(shù)(表2)。經(jīng)一致性檢驗,判別矩陣的一致性比例<0.10,表明權(quán)重系數(shù)合理有效。
權(quán)重系數(shù)計算公式:
1.2.10 單因素試驗[25]選取影響酒蒸工藝的幾個主要參數(shù),酒潤時間、料液比、酒蒸時間、酒蒸溫度,分別討論各參數(shù)對各指標的影響。試驗因素和水平見表1。
1.2.11 工藝優(yōu)化試驗 根據(jù)正交試驗設計原理,在單因素試驗結(jié)果的基礎上,選取料液比(A)、酒蒸時間(B)、酒蒸溫度(C)3個因素,每個因素設置3個水平(表1)。以多糖、皂苷、黃酮、醇提物、水溶物和水分6個指標為考察對象,進行L9(34)正交試驗,利用層次分析法進行多指標評價一步優(yōu)選玉竹酒蒸工藝。
從表3及圖1可以看出:4個因素對各指標的綜合得分均在第2水平達到最大值。即綜合得分在酒潤時間為2.0 h,料液比為100∶20、溫度為70℃及蒸煮時間為2.0 h時分別達到最高。圖1還顯示:酒潤時間各水平的綜合得分變化較平緩,說明該因素對各指標的影響較小。所以在正交試驗設計中不再考慮該因素。
圖1 單因素試驗結(jié)果Figure 1 Result of single factor experiment
根據(jù)正交試驗設計原理,在單因素試驗結(jié)果的基礎上,選取料液比(A),酒蒸時間(B),酒蒸溫度(C)3個因素,每個因素設置3個水平(表1)。以多糖、皂苷、黃酮、醇提物、水溶物和水分6個指標為考察對象,進行L9(34)正交試驗,利用層次分析法進行多指標評價一步優(yōu)選玉竹酒蒸工藝[26-27]。
直觀分析結(jié)果(表4)表明:以綜合評分為評價標準,在所選的因素水平范圍內(nèi),料液比對玉竹各指標的提取效果影響最大,酒蒸時間影響較小,酒蒸溫度影響最小。方差分析結(jié)果(表5)表明:料液比對綜合評分的影響均達到顯著水平,具有統(tǒng)計學意義(P=0.037),酒蒸溫度、酒蒸時間影響不顯著。選取最佳酒蒸條件為A2B3C1;即料液比為100∶20,酒蒸溫度為60℃,酒蒸時間為3.0 h。
表3 單因素試驗結(jié)果Table 3 Result of single factor experiment
表4 L9(34)正交試驗結(jié)果Table 4 Results of L9(34)orthogonal test
各因素不同水平間多重比較結(jié)果顯示(表6),料液比的后2個水平差異不顯著,酒蒸溫度、酒蒸時間的3個水平之間差異不顯著,因此,從節(jié)約原料,經(jīng)濟價值,減少能耗等方面考慮,本研究最終選取的酒蒸條件為A2B1C1;即料液比為100∶20,酒蒸溫度為60℃,酒蒸時間為1.0 h。
表5 正交試驗方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal test
本實驗結(jié)果表明:酒潤時間對玉竹各指標綜合得分的影響最小,料液比、酒蒸時間、酒蒸溫度3個因素對各指標綜合得分影響較大,且均在第二水平綜合得分最高。正交試驗分析結(jié)果表明:料液比對各指標綜合得分影響最顯著,酒蒸時間、酒蒸溫度兩因素均不顯著。綜合直觀分析、方差分析、多重比較、生產(chǎn)成本及周期,本研究最終選取的酒蒸條件為A2B1C1,即料液比為100∶20,酒蒸溫度60℃,酒蒸時間1.0 h。
中藥炮制和制藥、臨床應用關(guān)系密切,大部分藥材需經(jīng)過炮制才能用于臨床和制劑的生產(chǎn)。藥物在炮制過程中,往往需要加入一些輔料與藥物一起共制,目的在于消除有害物質(zhì),發(fā)揮有利作用。如酒、醋、鹽、姜、蜂蜜等,經(jīng)過添加不同的輔料炮制后起的作用各異。如酒蒸黃精可免去生用刺激咽喉的毒副作用[28-29];酒蒸黃芩可阻止黃芩素酶解,利于保存藥效等[30];酒蒸后的山萸肉補肝腎作用增強,常用于眩暈耳鳴、腰膝酸軟等癥[31]。由于玉竹炮制前、后與藥效相關(guān)的關(guān)鍵化學成分尚未完全明確,因此,有關(guān)玉竹酒蒸后具體的藥效變化及炮制機制還有待進一步研究。
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