TRPV1在FCDⅠ型和Ⅱa型難治性癲癇中的表達(dá)☆

伍苛夫 樹海峰 尹清 王法祥 臧振樂 趙邦云 張春青 劉仕勇 安寧 楊輝

皮質(zhì)發(fā)育障礙（malformations of cortical development,MCDs）是兒童難治性癲癇的主要病因之一。局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良（focal cortical dysplasia,FCD）是其主要類型之一，大致分為FCDI型、FCDIIa型、FCDIIb型和FCDIII型。目前，對FCDIIb型和FCDIII型的研究較多[1-3]。關(guān)于FCDI型和FCDIIa型癲癇發(fā)生機(jī)制的研究日趨成為人們關(guān)注的重點。近年來，非選擇性離子通道在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用正逐步引起廣泛重視。瞬時感受器電位（transient receptor potential,TRP）通道是位于細(xì)胞膜或胞內(nèi)細(xì)胞器膜上的一類非選擇性陽離子通道蛋白超家族，其中瞬時感受器電位辣椒素受體1型(TRPV1)是研究較多的TRP家族成員之一[4-7]。研究證據(jù)提示，TRPV1可能與癲癇發(fā)生機(jī)制之間關(guān)系密切。因此，本研究探討TRPV1與FCDI和FCDIIa的關(guān)系，可為研究FCD所致難治性癲癇的癲癇發(fā)生機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2011年12月至2012年5月本科室手術(shù)治療的FCD難治性癲癇患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合FCD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，有癲癇發(fā)作的典型表現(xiàn)和腦電圖特征，正規(guī)服用過3種或3種以上一線抗癲癇藥(苯妥英鈉、卡馬西平、丙戊酸鈉、苯巴比妥)，除丙戊酸鈉外，血藥濃度在正常高線，與發(fā)作前基線比較，發(fā)作頻率沒有明顯減少；②術(shù)前行頭顱CT或MRI檢查；③患者的發(fā)作類型符合國際抗癲癇聯(lián)盟1981年有關(guān)癲癇發(fā)作類型分類的規(guī)定；④手術(shù)前1周放置硬膜下電極，術(shù)中用皮質(zhì)電極進(jìn)行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)有明確和固定的癲癇放電部位，有手術(shù)適應(yīng)證，且能進(jìn)行手術(shù)者；⑤所有標(biāo)本的采集在醫(yī)院倫理委員會的指導(dǎo)下進(jìn)行，患者及其家屬術(shù)前簽署知情同意書。FCD的分型參照2011年國際抗癲癇聯(lián)盟公布的最新分型標(biāo)準(zhǔn)。本組20例，男10例，女10例，年齡1.5～10.2歲，平均（5.6±2.3）歲，病程10～210個月。我們用8位尸檢患者的新鮮正常皮層作為對照。對照患者生前無神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由新橋醫(yī)院病理科醫(yī)師通過病理切片證實腦皮層結(jié)構(gòu)無異常，家屬同意,并簽署知情同意書。其中男4例，女4例，年齡3～15歲，平均（8.1±3.4）歲。將收集的組織標(biāo)本中出血、電灼的組織除去，等滲鹽水沖洗干凈后一部分用4%多聚甲醛內(nèi)固定，石蠟包埋。另一部分新鮮組織液氮速凍后存入-80℃冰箱，用于后續(xù)實驗。根據(jù)臨床診斷和病理診斷的結(jié)果，將收集的標(biāo)本分為FCDI型、FCDIIa型以及正常皮層對照組（CTX）。本實驗均在第三軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會的監(jiān)督和規(guī)范下進(jìn)行。

1.2 RT-PCR檢測TRPV1 mRNA水平 用Trizol一步法（試劑盒購自武漢博士德公司）提取100mg組織總RNA，并進(jìn)行RNA樣品的的純度和濃度鑒定，選取D260/D280比值為1.9～2.1的樣品進(jìn)行下一步實驗。取1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒購自江蘇碧云天生物公司）。TRPV1上游引物序列5-CCT GAT GGC AAG GAC GAC TA-3，下游引物序列5-AGG GCA AAG TTC TTC CAG TGT C-3，產(chǎn)物長度182bp；β-actin上游引物序列5-GCA CCA CAC CTT CTA CAA TGA GC-3，下游引物序列5-TAG CAC AGC CTG GAT AGC AAC G-3，產(chǎn)物長度163bp（TRPV1引物由英濰捷基上海貿(mào)易有限公司設(shè)計并合成）。PCR（20μL體系）反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃ 5 min、95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s(30個循環(huán))、終末延伸 72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，加樣量為8μL，電壓160V，時間25 min，電泳完畢后在溴化乙錠(EB)中染色，在紫外燈下觀察結(jié)果并照相。圖像采用Quantity One軟件測定各條帶（TRPV1與內(nèi)參β-actin）的灰度值，比較二者的比值。

1.3 Western Blot檢測TRPV1蛋白水平 取組織約100 mg碾碎，加入全蛋白提取液勻漿15 min,4℃、12000 r/min離心30min，提取總蛋白，取蛋白樣品40 μg經(jīng)8%SDS2 PAGE凝膠電泳分離（蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自武漢谷歌生物公司），電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，經(jīng)麗春紅染色鑒定并標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)蛋白位置，5%脫脂奶粉封閉，TRPV1一抗及二抗孵育（兔抗人TRPV1一抗購自以色列Alomone公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物公司）。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影（超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒BeyoECL Plus購自碧云天生物技術(shù)研究所），Quantity One軟件掃描計算灰度值，以β-actin為內(nèi)參照。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測TRPV1表達(dá) 標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋7μm連續(xù)切片，分別行常規(guī)蘇木素伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色。免疫組化采用SABC三步法，按試劑盒操作說明進(jìn)行（羊抗兔SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、兔抗人TRPV1一抗購自武漢博士德公司）。顯色試劑為高敏感二氨基聯(lián)苯胺（DAB）。陰性對照取相同量的一抗稀釋液代替TRPV1抗體，其余步驟同上。

1.5 免疫組化染色評估分析 每個標(biāo)本隨機(jī)選取5張切片，在×200視野下，于皮質(zhì)逐層分別隨機(jī)選取10個非重復(fù)區(qū)域，通過半定量“3分”模式計算染色強(qiáng)度，即:?，陰性（0分）；+，弱陽性（1分）；++中等（2分）；+++，強(qiáng)陽性（3分）；在選定的區(qū)域計算染色強(qiáng)度值（intensity score，IR）。此外，利用吸光密度測量法（optical density measurement）定量評估免疫組化結(jié)果。使用裝備了數(shù)碼照相機(jī)的光學(xué)顯微鏡（Leica，德國）獲取×100視野下10個連續(xù)但不重疊區(qū)域，通過Image Pro-Plus圖像分析軟件，分別測量陽性結(jié)果光密度平均值與陰性背景光密度平均值，計算二者比值即相對光密度值（ratio of mean optical density，ODR）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12.0進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均以（）表示，行單因素方差分析和LSD-t檢驗。檢測水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TRPV1 mRNA的表達(dá) 如圖1所示，在所有實驗組可以觀察到預(yù)期的擴(kuò)增條帶TRPV1(182 bp)和β-actin(163 bp)?；叶确治鼋Y(jié)果顯示，F(xiàn)CDI組（0.999±0.037，n=10）和FCDIIa組（1.113±0.097，n=10）TRPV1的相對灰度值顯著大于CTX組（0.456±0.036，n=8），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。但FCDI組和FCDIIa組進(jìn)行兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 TRPV1蛋白的表達(dá) 如圖2所示，在所有實驗組可以觀察到預(yù)期的蛋白條帶TRPV1(95kD)和β-actin(37kD)?；叶确治鼋Y(jié)果顯示，F(xiàn)CDI組（1.044±0.059，n=10）和FCDIIa組（1.001±0.064，n=10）TRPV1的相對灰度值顯著大于CTX組（0.553±0.029，n=8），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但FCDI組和FCDIIa組進(jìn)行兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。

2.3 免疫組織化學(xué)觀察TRPV1的表達(dá) 如圖3所示，正常大腦皮質(zhì)中TRPV1弱到中度表達(dá)。然而，在FCD病理切片上，我們發(fā)現(xiàn)TRPV1高表達(dá)于病灶皮質(zhì)。高倍鏡（×400）下，在CTX中，TRPV1主要表達(dá)于神經(jīng)元和膠質(zhì)樣細(xì)胞。在FCDI型和FCDIIa型病灶中，TRPV1在柱形結(jié)構(gòu)（86%±2%）和異型神經(jīng)元（90%±3%）上呈強(qiáng)陽性表達(dá)。免疫組化染色評估分析提示，染色強(qiáng)度值（IR）和相對光密度值（ODR）均明顯高于CTX皮質(zhì)（表 1）(FCDI型 IR:P=0.026;ODR:P=0.019；FCDIIa型IR:P=0.023;ODR:P=0.021)

圖1 RT-PCR檢測TRPV1 mRNA在正常皮層（CTX）及局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良I型（FCDI）和IIa型（FCDIIa）中的表達(dá)情況

圖2 Western-blot檢測TRPV1蛋白在正常皮層（CTX）及局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良I型（FCDI）和IIa型（FCDIIa）中的表達(dá)情況

圖3 HE染色及 CTX、FCDI、FCDIIa中 TRPV1的表達(dá) A～C：CTX；D～F：FCDI；G～I(xiàn)：FCDIIa。A、D、G為HE染色，B、C、E、F、H、I為免疫組織化學(xué)；A、B、D、E為鏡下100倍，G、H為鏡下200倍，C、F、I為鏡下400倍；標(biāo)尺均表示50μm

表1 TRPV1免疫反應(yīng)強(qiáng)度評分

3 討論

局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良是許多難治性癲癇的病理學(xué)基礎(chǔ)，目前難治性癲癇須行外科治療[1-3]，因此在FCD所致難治性癲癇的預(yù)防、診斷和治療方面，對皮層發(fā)育不良的形成機(jī)制及其致癇性的研究至關(guān)重要。而FCDI型和FCDIIa型癲癇發(fā)生機(jī)制的研究日趨成為人們關(guān)注的重點。有報道稱，F(xiàn)CD組織中的異常細(xì)胞的不同類型及結(jié)構(gòu)有著獨特的形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)特性。因此，這些異常細(xì)胞類型和結(jié)構(gòu)在FCD患者的致癲癇發(fā)作和病理發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮著重要作用?！爸谓Y(jié)構(gòu)”和異型神經(jīng)元是FCDI和FCDIIa的神經(jīng)病理學(xué)特征性標(biāo)志，影響神經(jīng)遞質(zhì)的分泌和突觸傳遞，與癲癇的發(fā)作之間聯(lián)系密切[1，13-17]。

近年來，國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)非選擇性離子通道在癲癇發(fā)病機(jī)制中有著重要的作用。瞬時感受器電位（TRP）通道是位于細(xì)胞膜或胞內(nèi)細(xì)胞器膜上的一類非選擇性陽離子通道蛋白超家族。作為最被大家熟知和認(rèn)識的一員——TRPV1經(jīng)證實其可能與癲癇發(fā)生機(jī)制之間關(guān)系密切。TRPV1主要表達(dá)在初級傳入感覺神經(jīng)元上，存在于外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要對鈉、鉀、鈣離子有通透性，對鈣離子調(diào)節(jié)細(xì)胞信號起門控作用，能影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸傳遞，影響局部神經(jīng)通路的興奮性，是癲癇發(fā)作的一個促成因素[8-12]。我們利用RT-PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)TRPV1在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平都較正常對照皮層顯著升高，提示TRPV1表達(dá)上調(diào)可能是FCD所致難治性癲癇的發(fā)生機(jī)制之一。免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)TRPV1主要分布在FCDI和FCDIIa皮質(zhì)癲癇病灶內(nèi)的“柱形結(jié)構(gòu)”和異型神經(jīng)元上且呈高水平的表達(dá)。因此我們可以推測，TRPV1受體在“柱形結(jié)構(gòu)”和異型神經(jīng)元上激活，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，而且增強(qiáng)突觸傳遞，影響局部神經(jīng)通路的興奮性，最終導(dǎo)致難治性癲癇的發(fā)生。當(dāng)然，這一切還需要進(jìn)一步的電生理研究來證實。由于研究中樣本量有限的關(guān)系，可能導(dǎo)致了FCDI和FCDIIa之間存在的些許差異，但其較對照組呈高表達(dá)的趨勢是顯而易見的。

另有研究證實，癲癇患者腦內(nèi)存在神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）基因在這一過程中可能發(fā)揮了重要的作用[18]。有研究發(fā)現(xiàn)caspase-3在異型神經(jīng)元中的表達(dá)說明FCDIIb患者癲癇病灶中凋亡的存在[19]。但是，細(xì)胞凋亡參與癲癇發(fā)生的機(jī)制當(dāng)前仍在討論中。是否FCDI和FCDIIa中的“柱形結(jié)構(gòu)”和異型神經(jīng)元也存在細(xì)胞凋亡的標(biāo)記物的表達(dá)，還需進(jìn)一步研究。

本研究采用RT-PCR、Western Blot和免疫組化相結(jié)合的方法檢測TRPV1在FCDI和FCDIIa所致的難治性癲癇病灶中的表達(dá)情況。研究結(jié)果表明TRPV1的高表達(dá)可能與FCDI和FCDIIa致癲癇發(fā)作有關(guān)。但FCD的致癇性是一個復(fù)雜的過程，目前對TRPV1在其中如何發(fā)揮作用尚不完全清楚。本研究僅對TRPV1在FCD所致的難治性癲癇發(fā)生機(jī)制中的作用進(jìn)行了初步探討，但TRPV1的具體作用機(jī)制以及其可否成為難治性癲癇的藥物治療靶點，還有待更進(jìn)一步研究。

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