血腦屏障緊密連接損壞引起大鼠高血壓性腦白質(zhì)病變☆

楊嫻 藍(lán)琳芳 邢世會(huì) 曾進(jìn)勝 范玉華

腦白質(zhì)病變（white matter lesions，WML）又稱腦白質(zhì)改變（white matter changes,WMC），曾經(jīng)也被稱為白質(zhì)疏松（leukoaraiosis）,影像學(xué)上表現(xiàn)為腦室周圍或皮質(zhì)下半卵圓中心區(qū)存在CT上的白質(zhì)斑片狀或彌漫性低密度灶，或MRI T2加權(quán)圖像的高信號(hào)改變。其可以增加腦卒中、認(rèn)知障礙、癡呆和死亡的風(fēng)險(xiǎn)。高齡和高血壓是最重要的危險(xiǎn)因素。然而，作為可以被干預(yù)的危險(xiǎn)因素——高血壓導(dǎo)致WML的有關(guān)機(jī)制尚未闡明。目前，血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)破壞被認(rèn)為與WML發(fā)病有關(guān)[1-3]。BBB最重要的結(jié)構(gòu)是毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接（tight junction,TJ），TJ在高血壓性WML中的變化及其促成腦白質(zhì)病變的機(jī)制研究國(guó)內(nèi)外均少有報(bào)道。原因方面是目前用于研究WML的動(dòng)物模型包括雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄模型[4-5]及自發(fā)性高血壓易卒中大鼠（spontaneously hyperten?sive stroke prone，SHRSP）[6-7]，均仍存在很大的不足之處。易卒中型腎血管性高血壓大鼠（strokeprone renalvascular hypertensive rats,RHRSP）的研究在高血壓后不同時(shí)間腦組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)大鼠存在腦白質(zhì)組織疏松和腔隙病灶[8]，這一動(dòng)物模型中WML的發(fā)病與人類發(fā)病過程均有高血壓的基礎(chǔ)。因此，我們的研究采用RHRSP模型，觀察腦白質(zhì)病理改變及探討高血壓所致TJ損壞在高血壓性WML發(fā)病中可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 健康雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量60～90 g,由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組和高血壓4周、8周、12周、20周、30周組，每組15只。

1.2 易卒中型腎血管性高血壓大鼠（RHRSP）模型制作與血壓測(cè)量 按已定型的雙腎雙夾法[8]復(fù)制RHRSP。假手術(shù)組未鉗夾腎動(dòng)脈。不同時(shí)間點(diǎn)用ML866 Powerlab 4/30型大鼠血壓計(jì)（AD Instru?ments Pty Ltd，澳大利亞）經(jīng)尾動(dòng)脈測(cè)定收縮壓。

1.3 WML分級(jí) 10%水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后經(jīng)左心室向主動(dòng)脈插管，剪開右心房，快速灌注4℃生理鹽水100mL，至右心房流出清澈無血性液體后再以200mL 4%多聚甲醛+0.1mmol/L PBS溶液（pH7.4，4℃）固定腦組織，開顱取腦，后固定24 h，梯度蔗糖脫水；OCT包埋后行冰凍切片，片厚10μm，HE染色光鏡檢查進(jìn)行腦白質(zhì)病變分級(jí)，評(píng)估腦白質(zhì)的4個(gè)區(qū)域：胼胝體、尾核、外囊、內(nèi)囊；分級(jí)參照Wakita等[9]分級(jí)法，即0級(jí)：正常；1級(jí)：神經(jīng)纖維纏結(jié)；2級(jí)：明顯的空泡形成；3級(jí)：有髓神經(jīng)纖維消失。

1.4 透射電鏡觀察TJ 大鼠麻醉后，經(jīng)左心室向主動(dòng)脈插管，剪開右心房，快速灌注4℃生理鹽水100mL，再以2%多聚甲醛、2.5%戊二醛混合液500mL灌注后開顱取腦，將腦白質(zhì)胼胝體取出并置于后固定液中。按照標(biāo)準(zhǔn)的電鏡操作過程制作半薄、超薄切片，鈾鉛雙染后在80 kV條件下用JEM-1200EX型透射電鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)改變情況。

1.5 間接免疫熒光檢測(cè)白蛋白滲出 枸櫞酸中抗原修復(fù),正常兔血清室溫孵育90 min。濾紙吸干封閉血清,滴加經(jīng)抗體稀釋液稀釋的綿羊抗albumin抗體（LSBio），4℃濕盒孵育過夜。0.01 mol PBS(pH7.4)漂洗 5 min×3 次，滴加 FITC標(biāo)記兔抗綿羊二抗（Bioworld），避光孵育60 min，漂洗5 min×3次，抗熒光淬滅封片，熒光顯微鏡觀察并照相。

1.6 Loyez神經(jīng)纖維染色 冰凍切片放入4%鐵明礬水溶液24 h,多次蒸餾水洗，用新配的碳酸鋰蘇木素染液染24 h,0.5%鹽酸乙醇分化10 s,充分流動(dòng)水洗，使之返藍(lán)。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 RHRSP模型血壓監(jiān)測(cè)結(jié)果 RHRSP血壓逐漸升高。與假手術(shù)組比較，術(shù)后4周、8周、12周、20周、30周組血壓明顯升高（P＜0.05）；模型組術(shù)后4周、8周血壓較前明顯升高（P＜0.01），而術(shù)后12周、20周、30周血壓差異不明顯（P＞0.05），12周后血壓趨于平穩(wěn)（表1）。

2.2 WML分級(jí) RHRSP模型組WML隨著時(shí)間延長(zhǎng)加重。胼胝體、尾核、外囊、內(nèi)囊區(qū)域都可觀察到相應(yīng)病理變化。與假手術(shù)組相比，術(shù)后4周開始出現(xiàn)輕度的病變（P＞0.05），8周始胼胝體病變明顯（P＜0.05），隨后加重，尾核、外囊、內(nèi)囊逐漸受累；術(shù)后組間比較，20周時(shí)胼胝體病變較前顯著（P＜0.05），其余3個(gè)區(qū)域在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較前沒有顯著差異；病變最明顯的部位在胼胝體（表2）。

2.3 BBB超微結(jié)構(gòu)觀察 假手術(shù)組TJ完整，血管形態(tài)平滑。RHRSP4周及8周組相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間吻合緊密，TJ連續(xù)；12周時(shí)27個(gè)TJ中8個(gè)連續(xù)性破壞，基底膜增厚；20周時(shí)24個(gè)TJ中9個(gè)連續(xù)中斷，血管明顯扭曲，細(xì)胞器明顯腫脹，細(xì)胞內(nèi)空泡形成；30周時(shí)20個(gè)TJ中有11個(gè)斷裂（圖1）。

2.4 腦白質(zhì)白蛋白漏出間接免疫熒光結(jié)果RHRSP 4周、8周、12周組腦實(shí)質(zhì)及血管周圍未見血漿白蛋白漏出；20周組胼胝體可見吞噬白蛋白的膠質(zhì)細(xì)胞，血管周圍白蛋白熒光增強(qiáng)；30周組可見顆粒狀白蛋白漏出，遍及腦實(shí)質(zhì)，白質(zhì)區(qū)域以胼胝體及尾核漏出最明顯，血管周圍白蛋白漏出較前減少（圖2）。

2.5 Loyez神經(jīng)纖維染色結(jié)果 Loyez神經(jīng)纖維染色顯示假手術(shù)組大鼠神經(jīng)纖維排列整齊、緊密。與假手術(shù)比較，RHRSP 4周組腦白質(zhì)神經(jīng)纖維排列整齊；8周組出現(xiàn)纖維紊亂；12周組可見空泡形成；20周組腦白質(zhì)可見明顯的疏松，神經(jīng)纖維纏結(jié)、斷裂；30周組疏松較前加重（圖3）。腦白質(zhì)疏松最明顯的區(qū)域在胼胝體。

表1 RHRSP不同時(shí)間點(diǎn)血壓（mmHg）變化情況

表2 不同時(shí)間點(diǎn)腦白質(zhì)病變分級(jí)結(jié)果

圖1 血腦屏障超微結(jié)構(gòu)形態(tài)改變（46000×） A：RHRSP 4周組相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間吻合緊密，緊密連接連續(xù)(▼示）；B：RHRSP 8周組緊密連接完整（▼示）；C：RHRSP 12周組緊密連接連續(xù)性中斷（?示）；D：RHRSP 20周組緊密連接連續(xù)性中斷（?示），血管明顯扭曲；E：RHRSP 30周組緊密連接斷裂（?示）F：假手術(shù)組緊密連接完整連續(xù)（▼示）

圖3 Loyez神經(jīng)纖維染色觀察（200×）A:RHRSP 4周組神經(jīng)纖維排列整齊B：RHRSP 8周組神經(jīng)纖維排列紊亂C：RHRSP 12周組神經(jīng)纖維排列紊亂，空泡形成（?示）D：RHRSP 20周組腦白質(zhì)明顯疏松，神經(jīng)纖維纏結(jié)、斷裂（?示）E:RHRSP 30周組腦白質(zhì)疏松較前加重（?示）F：假手術(shù)組神經(jīng)纖維排列緊密、整齊

3 討論

WML是影像學(xué)診斷，對(duì)55歲以上的無神經(jīng)精神癥狀的健康老年人行MRI檢查，發(fā)現(xiàn)13.9%存在3級(jí)以上的重度WML[10]。其病理學(xué)上表現(xiàn)為髓鞘脫失、星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、小膠質(zhì)細(xì)胞激活。它既反映了正常老齡化過程中的神經(jīng)退行性改變，又存在與不同程度的小血管病變相聯(lián)系的病理改變,日益得到重視。

國(guó)外常采用雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄模型研究WML，但與人類的發(fā)病過程相差甚遠(yuǎn)，完全沒有考慮到年齡和血壓的影響。SHRSP雖然接近人類的生理，但是來源少，價(jià)格貴，限制了其應(yīng)用。深入探討WML發(fā)病機(jī)制，需要找到更適用的動(dòng)物模型。RHRSP常被應(yīng)用于腦卒中研究，而我們發(fā)現(xiàn)，RHRSP也是適用的WML動(dòng)物模型，首先，通過夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈誘導(dǎo)的慢性進(jìn)行性高血壓，進(jìn)而誘發(fā)腦白質(zhì)病變，與人類的發(fā)病過程，即慢性高血壓性腦白質(zhì)病變發(fā)病過程相似；其次，病理染色顯示病程中出現(xiàn)腦白質(zhì)疏松、膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)纖維纏結(jié)、缺失，與WML病理改變相符。我們的模型中病變最明顯的部位在胼胝體，這與雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄模型一致[11]，考慮與此區(qū)域供血血管來自于脈絡(luò)膜動(dòng)脈或豆紋動(dòng)脈終末支，與來源于大腦表面的血管相互之間的吻合稀疏或缺如有關(guān)。因此，當(dāng)發(fā)生腦缺血或低灌注時(shí)，該區(qū)域極易發(fā)生缺血性改變。

高齡和高血壓是腦白質(zhì)病變發(fā)病最重要的危險(xiǎn)因素。高血壓患者中，腦血管阻力增大、腦血管自動(dòng)調(diào)節(jié)功能下降與WML嚴(yán)重性相關(guān)[12]，腦血流動(dòng)力學(xué)的改變參與WML形成。本研究中高血壓12周前血壓升高迅速，卻未見明顯病變，12周后血壓相對(duì)平穩(wěn),此后才出現(xiàn)明顯的病變。推測(cè)單純高血壓并不一定會(huì)造成大鼠WML，至少要12周后，血管內(nèi)皮受到一定程度損傷，通過系列病理變化，才會(huì)出現(xiàn)明顯的WML。綜合病變分級(jí)，我們的研究支持高血壓與WML密切相關(guān)，可以促成其發(fā)生發(fā)展。這為臨床上對(duì)伴有高血壓的患者必須合理控制血壓提供依據(jù)。

BBB嚴(yán)格調(diào)控腦內(nèi)微環(huán)境。腦白質(zhì)缺血損害患者腦脊液白蛋白數(shù)量明顯增加[13]，而腦脊液白蛋白指數(shù)是BBB受損的一個(gè)標(biāo)記，提示白蛋白通過受損的BBB滲漏到腦脊液中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄制備的大鼠WML模型出現(xiàn)明顯BBB破壞[11,14]。夾閉單側(cè)頸總動(dòng)脈的SHRSP模型術(shù)后出現(xiàn)明顯IgG滲漏伴出血，提示屏障的損壞[15]。病理學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞激活和因此而導(dǎo)致的BBB破壞是腦小血管病包括腦白質(zhì)病變?cè)趦?nèi)的主要特征[16]。BBB破壞后，一些大分子物質(zhì)包括蛋白、細(xì)胞因子等進(jìn)入血管壁、血管周圍間隙以及腦組織造成功能損害和毒性，可能是WML的發(fā)病機(jī)制[17]。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）作為內(nèi)肽酶家族的一員，有下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)的作用，其中MMP-2在慢性腦內(nèi)低灌注狀態(tài)下BBB的破壞中起著重要的作用，雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄大鼠通過腹腔注射MMP-2抑制劑AG3340及對(duì)MMP-2基因敲除的小鼠進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)抑制MMP-2的表達(dá)可以通過減輕BBB破壞，進(jìn)而改善WML[18]。研究表明可以用放射示蹤劑及大分子標(biāo)記物如辣根過氧化物酶或伊文氏藍(lán)檢測(cè)BBB滲漏，而我們采用直接的白蛋白免疫熒光，發(fā)現(xiàn)病程中出現(xiàn)明顯的白蛋白漏出且逐漸增多，并且發(fā)現(xiàn)吞噬白蛋白的膠質(zhì)細(xì)胞，而且電鏡下TJ損壞逐漸增加，伴WML加重。進(jìn)一步支持BBB破壞在腦白質(zhì)損傷過程中可能起一定作用。我們認(rèn)為，BBB破壞，可使血漿中的蛋白等成份滲出至腦組織中，可以產(chǎn)生神經(jīng)纖維毒性作用，從而引起WML的發(fā)病。

總之，我們的研究顯示RHRSP模型是研究高血壓性WML的適用模型；長(zhǎng)期高血壓可以破壞BBB的TJ，從而引起血漿白蛋白的漏出，造成神經(jīng)毒性，引起WML。說明BBB如何破壞，如何引起WML的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

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