人臍血間充質(zhì)干細胞移植對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠VEGF分泌及血管新生的影響

趙俊暕 陳乃耀 石峻 王沂 孟愛國 韓曉燕 趙輝

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是威脅公眾健康的普遍問題。Marshall［1］等發(fā)現(xiàn)死于TBI的患者90%有缺血性改變，缺血是繼發(fā)性損害的主要機制。腦損傷灶周圍組織的新生血管形成是改善血循環(huán)的物質(zhì)前提，也是神經(jīng)細胞間突觸聯(lián)系、功能重建的基礎(chǔ)［2］。近年來人臍血間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）的深入研究，為腦損傷的治療及修復(fù)提供了新的思路［3］。本研究擬利用大鼠TBI模型，觀察人臍血MSCs在大鼠腦內(nèi)的遷移、分布，大鼠腦組織病理變化及干細胞移植后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況，以及人臍血MSCs對損傷腦組織血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular epidemal growth factor receptor，VEGF）、VEGF受體2（VEGF－R2）分泌與血管新生的影響，探討人臍血MSCs移植的腦保護作用機制，期望為腦損傷的干細胞治療提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:清潔級健康雄性SD大鼠90只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量250～350g，采取自然光照，自由進食喂養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器:人臍血MSCs（中國醫(yī)學科學院血液學研究所饋贈）；鼠抗人Brdu單克隆抗體、SP－9002免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)公司）；VEGF原位雜交檢測試劑盒（天津灝洋生物制品公司）；兔抗鼠 CD34、VEGF、VEGF－R2多克隆抗體、SABC即用型免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；Image－Pro Plus 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪儀器儀表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 MSCs標記:將人臍血 MSCs用完全DF－12培養(yǎng)液〔含10%（體積分數(shù)）FBS、100U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素、0.2mmol／L谷氨酰胺，均為培養(yǎng)液的終濃度〕常規(guī)細胞培養(yǎng)并換液至第4代，移植前72h于細胞培養(yǎng)基中加入Brdu（200 μmol／L）10μL。72h后，行Brdu細胞免疫組化鏈霉親和素－生物素法（streptavidin－peroxidase，SP法）檢測其標記率。細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，未著色為陰性。MSCs細胞的形態(tài)、生長及分化不受影響，標記率達到80～90%，可滿足移植細胞的標記需要，即可用于下一步實驗。

1.2.2 動物分組和TBI模型制作:將大鼠隨機分為假手術(shù)組、損傷對照組（對照組）和實驗組，每組均30只。對對照組和實驗組采用改良Feeney自由落體方法［4］制作大鼠TBI模型。以10%（質(zhì)量濃度）水合氯醛按體質(zhì)量3mL／kg劑量腹腔注射麻醉大鼠后，固定于立體定向儀上，于矢狀正中線切開頭皮約2.0cm，分離皮下組織及骨膜。暴露前囟、冠狀縫、矢狀縫和雙側(cè)頂骨，于右側(cè)冠狀縫后4mm，中線旁開2mm，以磨鉆磨除顱骨骨質(zhì)，做一直徑約5mm的骨窗，保持硬腦膜的完整。實驗組和對照組均使用自由落體儀以20 g擊錘從30cm高處自由墜落，撞擊該處硬腦膜，縫合頭皮。撞擊致傷力為0.048N·s，造成中度腦挫裂傷。致傷后實驗組和對照組所有大鼠均出現(xiàn)四肢抽搐，呼吸暫停數(shù)秒，術(shù)后昏迷2～10h，說明致傷成功，即TBI造模成功。假手術(shù)組只開骨窗，不撞擊硬腦膜。在造模操作后24h，實驗組所有大鼠均經(jīng)鼠尾靜脈緩慢注入3×106個／mL MSCs（以1mL PBS液溶解）1mL，留針5min后緩慢拔針；對照組和假手術(shù)組所有大鼠經(jīng)鼠尾靜脈注入等體積的PBS液（含NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO43.63g，KH2PO40.24g），注射后分籠喂養(yǎng)觀察大鼠，注射后所余MSCs行臺盼藍染色檢測細胞活性。注射后剩余細胞行臺盼藍染色，結(jié)果顯示90%以上細胞存活，說明MSCs細胞經(jīng)標記后生長存活基本不受影響，可滿足移植細胞標記需要，可用于下一步實驗。3組大鼠均未使用免疫抑制劑，所用試劑也無免疫抑制的作用。

1.2.3 神經(jīng)功能評價:分別于注射后第3、7、14、21和28天處死大鼠之前，由不了解實驗動物分組者參照Mahmood等［5］的方法，對對照組和實驗組分別采用神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴重程度評分（neurological severity score points，NSS）評價大鼠神經(jīng)功能，包括運動、感覺、反射和平衡實驗4部分，總分18分，13～18分表示嚴重損傷，7～12分表示中度損傷，1～6分表示輕度損傷。

1.2.4 腦組織標本制備和組織學評價:各組分別于注射后第3、7、14、21和28天，隨機選取6只大鼠，經(jīng)深度麻醉后處死，完整取出腦組織，切下?lián)p傷灶及其周邊3mm區(qū)域的腦組織，固定24h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，厚度約5μm，每只鼠腦組織做6張切片。

（1）HE染色:取每組大鼠腦組織切片各6張，200倍光鏡下分別觀察三組大鼠腦組織細胞結(jié)構(gòu)、胞質(zhì)、胞核，腦組織壞死細胞存在及多少。

（2）腦組織中Brdu免疫組化表達:取上述損傷周邊區(qū)腦組織切片每組大鼠各6張，進行Brdu免疫組織化學染色，按產(chǎn)品說明書進行。在400倍光鏡下觀察Brdu陽性細胞及其分布情況。隨機觀察損傷周邊皮質(zhì)區(qū)10個不重疊的視野（約0.25 mm2），計數(shù)Brdu陽性細胞平均數(shù)。細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Brdu陽性，未著色為陰性。

（3）血管新生及血管相關(guān)細胞因子檢測:取上述損傷周邊區(qū)腦組織切片每組每個時間點各6張，應(yīng)用抗CD34抗體免疫組化標記大鼠腦損傷周邊區(qū)腦組織血管內(nèi)皮細胞，CD34免疫組化（SABC鏈霉親和素－生物素－復(fù)合物法）檢測按產(chǎn)品說明書進行，以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。微血管密度（microvessell density，MVD）計數(shù)按 Weidner等［6］的方法進行，在400倍鏡下，每張切片在同一損傷周邊皮質(zhì)區(qū)選擇10個視野（約0.25mm2）進行微血管計數(shù)，并計算MVD，記取均值。微血管的判定:任何染成棕黃色的內(nèi)皮細胞或血管內(nèi)皮細胞簇，只要它們和鄰近的微血管、腫瘤細胞及其他結(jié)締組織不相連，即作為可計數(shù)的微血管，血管腔及腔內(nèi)的紅細胞均不作為計數(shù)微血管的條件。

取上述損傷周邊區(qū)腦組織切片每組每個時間點大鼠各6張，應(yīng)用抗VEGF、VEGF－R2抗體標記大鼠腦損傷周邊區(qū)腦組織VEGF和VEGF－R2，VEGF、VEGF－R2免疫組化（SABC 鏈霉親和素－生物素－復(fù)合物法）檢測均按產(chǎn)品說明書進行。以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，未著色者為陰性。用原位雜交法檢測VEGF mRNA，采用地高辛標記的VEGF mRNA寡核苷酸探針標記大鼠腦損傷周邊區(qū)腦組織血管內(nèi)皮生長因子mRNA，檢測按試劑盒說明，其陽性細胞為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者，未著色為陰性。通過Image－pro plus 6.0醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定吸光度〔D（λ）〕值，并根據(jù)所得 D（λ）值推導 VEGF、VEGF－R2及 VEGF mRNA陽性細胞的數(shù)量。D（λ）值越大，表示細胞數(shù)量越多。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。同一時間點三組中組間兩兩比較采用卡方檢驗，同一組中不同時間點比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠NSS評分 實驗組大鼠均未發(fā)現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)。假手術(shù)組NSS評分均為0。注射后第7、14、21、28天，實驗組NSS評分均低于對照組（P＜0.05）（表1）。

2.2 MSCs移植后腦組織形態(tài)學表現(xiàn) 光鏡下假手術(shù)組大鼠腦組織細胞結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯病理改變。胞質(zhì)被染成淡紅色，胞核呈藍色，部分細胞可見核仁（圖1A）。對照組大鼠腦組織受損皮層組織結(jié)構(gòu)破壞，損傷中心區(qū)可見大量的壞死細胞，胞核皺縮，細胞結(jié)構(gòu)消失（圖1B）。實驗組腦組織壞死范圍縮小，細胞結(jié)構(gòu)較對照組完整，細胞核固縮較對照組明顯減輕（圖1C）。

表1 注射后兩組大鼠NSS評分比較 （，n＝6）

表1 注射后兩組大鼠NSS評分比較 （，n＝6）

注:與對照組同一時點比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別3d 7d 14d 21d 28d實驗組 10.20±0.51 5.82±0.65＊ 4.18±0.68＊＊ 4.02±0.54＊＊ 3.46±0.47＊＊對照組 10.32±0.61 7.31±0.67 6.68±0.83 6.02±0.73 5.36±0.48

圖1 各組大鼠經(jīng)注射后3天腦損傷周邊區(qū)組織形態(tài)學表現(xiàn)（HE×200）A:假手術(shù)組；B:對照組；C:實驗組圖2 各組腦組織Brdu陽性的MSCs細胞比較（免疫組化染色SABC法×200）A:實驗組注射后第3天腦損傷灶周邊區(qū)（箭頭所示為Brdu標記的MSCs）；B:實驗組注射4周后腦損傷灶周邊區(qū)；C:實驗組注射后第3天腦損傷對側(cè)腦組織；D:對照組注射后第3天

2.3 MSCs移植后在腦內(nèi)的存活、分布 實驗組注射后第3天可見Brdu標記陽性的MSCs聚集在損傷部位，分布均勻（圖2A），4周后仍可見（圖2B）。損傷對側(cè)半球注射后第3天只見極少數(shù)的Brdu標記MSCs（圖2C）。假手術(shù)組和對照組注射后第3天均未見Brdu標記的MSCs（圖2D）。

2.4 腦組織損傷周圍皮質(zhì)區(qū)血管新生和細胞因子表達

2.4.1 大鼠腦損傷周邊區(qū)MVD檢測:造模操作后假手術(shù)組血管內(nèi)皮細胞極少；對照組腦損傷周圍皮質(zhì)區(qū)有較多散在分布的單個血管內(nèi)皮細胞；實驗組腦損傷周圍皮質(zhì)區(qū)有較多單個血管內(nèi)皮細胞和連成條索狀的血管樣結(jié)構(gòu)。假手術(shù)組MVD值極低。對照組和實驗組MVD值均于創(chuàng)傷后第14天達高峰，隨后對照組MVD下降，實驗組在創(chuàng)傷后第21、28天仍維持較高水平（對照組F＝7.32，P＜0.05；實驗組F＝4.06，P＜0.05），各時間點實驗組MVD值均高于對照組（P＜0.01）（表2，圖3）。

2.4.2 損傷周圍皮質(zhì)區(qū)腦組織VEGF蛋白表達:假手術(shù)組VEGF蛋白數(shù)量極少。注射后各時間點實驗組在損傷周邊區(qū)VEGF蛋白計數(shù)較對照組明顯增多（P＜0.05）。對照組和實驗組VEGF蛋白計數(shù)在注射后第7天達高峰，隨后對照組表達逐漸減弱，第21、28天實驗組表達仍維持較高水平（對照組F＝3.58，P＜0.05；實驗組F＝4.17，P＜0.05；表3，圖4）。

2.4.3 損傷周圍皮質(zhì)區(qū)腦組織VEGF－R2蛋白表達:假手術(shù)組VEGF－R2蛋白數(shù)量極少。注射后各時間點實驗組損傷周邊區(qū)VEGF－R2蛋白較對照組明顯增多（P＜0.05）；兩組 VEGF－R2蛋白計數(shù)均在注射后第3天達高峰，隨后對照組表達逐漸減弱，實驗組在第21天、28天表達仍可維持較高水平（對照組F＝4.53，P＜0.05；實驗組F＝4.10，P＜0.05；表4，圖5）。

表2 CD34標記的大鼠腦損傷后各組皮層腦組織MVD值 （血管數(shù)／mm2，，n＝6）

表2 CD34標記的大鼠腦損傷后各組皮層腦組織MVD值 （血管數(shù)／mm2，，n＝6）

注:與假手術(shù)組同一時間點比較，＊P＜0.01；與對照組同一時點比較，ΔP＜0.01

組別3d 7d 14d 21d 28d實驗組 23.22±2.87＊Δ 27.12±1.89＊Δ 32.33±2.88＊Δ 30.90±2.78＊Δ 30.32±1.90＊Δ對照組 17.73±1.78＊ 19.50±2.06＊ 22.05±2.31＊ 17.12±2.44＊ 13.20±1.98＊假手術(shù)組2.3±0.3 2.2±0.3 2.3±0.2 2.3±0.3 2.2±0.2

表3 大鼠腦損傷后各組皮層區(qū)腦組織VEGF蛋白表達結(jié)果 〔D（λ）值，n＝6〕

注:與假手術(shù)組同一時間點比較，＊P＜0.01；與對照組同一時點比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組別3d 7d 14d 21d 28d實驗組 0.52±0.05＊Δ 0.62±0.08＊Δ 0.56±0.08＊ΔΔ 0.53±0.05＊ΔΔ 0.51±0.05＊ΔΔ對照組 0.41±0.05＊ 0.45±0.07＊ 0.38±0.04＊ 0.28±0.04＊ 0.19±0.03＊假手術(shù)組 0.03±0.01 0.04±0.01 0.05±0.01 0.03±0.01 0.04±0.01

圖3 各組大鼠經(jīng)注射后14d腦損傷周邊區(qū)MVD（圖中箭頭所示為CD34抗體標記的血管內(nèi)皮細胞）（SABC法×400）圖4 各組大鼠經(jīng)注射后7d腦損傷周邊區(qū)VEGF表達（箭頭所示為抗VEGF抗體標記的VEGF陽性細胞）（SABC法×400）圖5 各組大鼠經(jīng)注射后3d腦損傷周邊區(qū)VEGF－R2表達（箭頭所示為抗VEGF－R2抗體標記的VEGF受體2陽性細胞）（SABC法×400）圖6 各組大鼠經(jīng)注射后3d腦損傷周邊區(qū)VEGF mRNA表達（箭頭所示為地高辛標記的VEGF mRNA陽性細胞）（原位雜交×400）

表4 大鼠腦損傷后各組皮層區(qū)腦組織VEGF－R2蛋白表達結(jié)果 〔D（λ）值，n＝6〕

表4 大鼠腦損傷后各組皮層區(qū)腦組織VEGF－R2蛋白表達結(jié)果 〔D（λ）值，n＝6〕

注:與假手術(shù)組同一時間點比較，＊P＜0.01；與對照組同一時點比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組別3d 7d 14d 21d 28d實驗組 0.63±0.06＊Δ 0.62±0.06＊ΔΔ 0.57±0.07＊ΔΔ 0.56±0.04＊ΔΔ 0.54±0.04＊ΔΔ對照組 0.51±0.05＊ 0.48±0.03＊ 0.38±0.03＊ 0.26±0.04＊ 0.21±0.01＊假手術(shù)組 0.04±0.01 0.05±0.01 0.03±0.01 0.03±0.01 0.04±0.01

表5 大鼠腦損傷后各組損傷周圍區(qū)腦組織VEGF mRNA表達 〔D（λ）值，，n＝6〕

表5 大鼠腦損傷后各組損傷周圍區(qū)腦組織VEGF mRNA表達 〔D（λ）值，，n＝6〕

注:與假手術(shù)組同一時間點比較，＊P＜0.01；與對照組同一時點比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組別3d 7d 14d 21d 28d實驗組 0.57±0.04＊Δ 0.52±0.04＊Δ 0.47±0.03＊Δ 0.46±0.06＊ΔΔ 0.44±0.05＊ΔΔ對照組 0.47±0.03＊ 0.43±0.03＊ 0.39±0.03＊ 0.30±0.04＊ 0.21±0.02＊假手術(shù)組 0.04±0.01 0.05±0.01 0.04±0.01 0.03±0.01 0.04±0.01

2.4.4 損傷周圍區(qū)腦組織VEGF mRNA表達 假手術(shù)組VEGF mRNA數(shù)量極少。相同時間點實驗組VEGF mRNA較對照組明顯增多（P＜0.05）；對照組和實驗組VEGF mRNA均在3天達高峰，此后對照組表達逐漸減弱，實驗組在21天、28天仍維持較高水平（對照組F＝4.59，P＜0.05；實驗組F＝5.00，P＜0.05；表5，圖6）。

3 討論

MSCs的低免疫原性［7］，使其很難被HLA不相容受體所識別，因而MSCs細胞可應(yīng)用于異源性或異種的移植治療中。大量研究報道骨髓MSCs移植用于治療心肌缺血［8］、心肌梗死、急性肢體缺血［9］、腦出血、神經(jīng)元變性疾?。?0］均取得顯著效果。但骨髓MSCs只能通過骨髓穿刺獲取，可能對患者身心造成一定傷害，且這類細胞的增殖效率和分化潛能也會隨著時間而減弱［11］。臍血源MSCs與骨髓源MSCs相比較，其來源廣泛，取材方便，無倫理學爭議，且干細胞量大、易于分離純化；受病毒、細菌污染的機率很低［12－13］，是一種可靠的細胞來源。

本實驗中發(fā)現(xiàn)人臍血MSCs經(jīng)靜脈植入到大鼠TBI模型后，可在腦組織內(nèi)環(huán)境中定居存活，并可短時間內(nèi)趨向遷移到腦損傷周圍皮質(zhì)區(qū)，4周后仍可見存活MSCs，而對側(cè)聚集較少，且均未發(fā)現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，與Lu等［14］的研究較為一致，表明臍血MSCs免疫原性低，適合做供體細胞用于移植治療。

研究發(fā)現(xiàn)人臍血MSCs和脂肪源成人MSCs在移植后沒有高效分化出神經(jīng)元的表型［15－16］，而這些植入細胞能否與宿主腦組織建立起有功能的突觸連接尚不能確定。因此TBI后神經(jīng)功能的改善，還不能歸功于移植細胞的轉(zhuǎn)化替代。有研究表明神經(jīng)營養(yǎng)因子對促進損傷神經(jīng)元修復(fù)和再生具有很重要的作用［17］。本文作者前期的研究表明人臍血MSCs移植能顯著上調(diào)腦組織損傷周邊區(qū)因子BDNF和NGF的表達量和表達時間，顯著降低細胞凋亡數(shù)量［18］，可見 MSCs可由局部的因子分泌發(fā)揮作用。

有研究表明血管新生對于啟動和促進損傷后的神經(jīng)再生發(fā)揮著重要作用，盡快恢復(fù)內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能、促進腦損傷缺血區(qū)新血管生成，可以改善腦組織代謝，促進半暗帶區(qū)受損而未死亡的神經(jīng)元的修復(fù)［19］，誘導新的神經(jīng)元發(fā)生；加速清除毒性產(chǎn)物；輸送氧和營養(yǎng)成份，為植入的細胞成活、遷移和分化提供良好的微環(huán)境［20］。本研究中作者應(yīng)用外源MSCs靜脈植入TBI模型大鼠后，大鼠腦損傷周邊區(qū) VEGF mRNA、VEGF、VEGF－R2因子表達量顯著上調(diào)、表達時間延長，放大了VEGF和VEGF－R 2蛋白參與腦損傷后血管新生和神經(jīng)修復(fù)的反應(yīng)過程，使損傷周邊區(qū)新生血管數(shù)量明顯增加，加速了神經(jīng)功能恢復(fù)的速度。既往研究已明確VEGF具有促進血管生成的作用，其可能機制為移植的人臍血MSCs與腦組織微環(huán)境相互作用，促進血管新生因子的分泌，并且其本身也可能具有通過自分泌和旁分泌途徑直接分泌VEGF等因子的潛在能力［21］，增加缺血部位血管新生，進而使血供得到改善，有利于遷移至損傷缺血部位的人臍血MSCs和神經(jīng)細胞的生存，進一步增加促血管新生因子的分泌。

綜上可見，MSCs移植促進受損腦組織的神經(jīng)功能修復(fù)的可能機制，除與增加神經(jīng)營養(yǎng)因子表達有關(guān)外，尚可能通過促進損傷區(qū)VEGF、VEGF－R2表達和血管新生而實現(xiàn)，提示人臍血MSCs移植為TBI提供一種治療新方法。

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