鴨腸炎病毒VP5蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

李慧昕，劉勝旺，韓宗璽，邵昱昊，劉曉麗，華育平，劉 娣，孔憲剛

（1.東北林業(yè)大學博士后流動站 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院博士后工作站，黑龍江 哈爾濱150086；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室 禽傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱150001）

鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis，DVE），是由鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的鴨、鵝及多種雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病［1］。其特征是流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高［2］。1923年該病由Baudet 首次在荷蘭報道，我國于1957年首次暴發(fā)鴨病毒性腸炎［3］，隨后該病在華南、華中和華東等養(yǎng)鴨較發(fā)達的地區(qū)發(fā)生流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失［4］。水禽和候鳥是本病病原的儲存宿主，且?guī)Ф鹃L達4年之久［5］，為本病的有效防控帶來困難。

第9次國際病毒分類報告將DEV歸類為皰疹病毒科、α－皰疹病毒亞科、馬立克病毒屬成員。DEV具有皰疹病毒典型結構特征，病毒DNA核心外依次包被著衣殼、皮層和囊膜［6－7］。病毒衣殼至少由7個蛋白組成，包括 VP5（UL19）、VP19C（UL38）、P21前體（UL26）、p22a（UL26.5）、VP23（UL18）、VP24（UL26）和VP26（UL35），其中 VP5為病毒的主要衣殼蛋白，占病毒衣殼總成分的60%～70%［8］。在單純皰疹病毒（HSV－1）和水痘帶狀皰疹病毒（VZV）感染宿主后，VP5是引起機體產(chǎn)生體液免疫的主要抗原之一［9－11］。在皰疹病毒中VP5同源蛋白較為保守且功能相近［12－13］，因此推測，DEV VP5在病毒感染過程中發(fā)揮相似的作用。

DEV基因組解析相較其他皰疹病毒滯后，DEV VP5在病毒復制過程中的功能尚未見報道。本研究制備DEV VP5蛋白的單克隆抗體，為VP5蛋白的抗原表位研究及其在病毒復制過程中的功能研究提供了有效工具，同時為建立鴨病毒性腸炎檢測方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞 鴨腸炎病毒DEV Clone－03株由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽傳染病研究室保存，SP2/0細胞由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽傳染病研究室保存。

1.2 實驗動物及主要試劑 6～8周齡雌性BABL/c小鼠由哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。HAT、HT、聚乙二醇（PEG1500），購自 Gibco公司；羊抗鼠HRP－IgG，購自Sigma公司；IgG抗體亞類試劑盒為Southern Biotech公司產(chǎn)品；免疫用抗原VP5－C蛋白由本研究室表達及純化。

1.3 動物免疫 以本研究室制備的DEV Clone－03 VP5－C蛋白作為抗原，免疫8周齡雌性BABL/c小鼠。首次免疫，抗原與等體積SEPPIC IMS1312佐劑乳化，腹部皮下及背部皮下多點注射，50μg/只鼠。每隔兩周進行加強免疫，共計免疫3次，劑量及免疫途徑同首免。三免后2周，進行加強免疫，采取腹腔及尾靜脈注射50μg VP5－C抗原，于末次免疫后3d無菌取出脾細胞與SP2/0進行融合。

1.4 細胞融合 按常規(guī)方法進行細胞融合，取免疫鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按細胞數(shù)量4∶1混合，以50%PEG為融合劑，將融合的細胞鋪到已加有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，100μL/孔，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后的細胞每3天更換培養(yǎng)基1次，使用含有HAT或HT培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)液。待雜交瘤細胞長至孔底部的1/3～1/2時，于換液后3～4d取細胞培養(yǎng)上清100μL，用建立的ELISA檢測方法進行檢測，以免疫小鼠血清為陽性對照、未免疫小鼠血清及SP2/0上清為陰性對照。將ELISA檢測陽性孔的細胞進行亞克隆，采用有限稀釋法進行。亞克隆3～4次，直至所有克隆化細胞孔檢測陽性率為100%。

1.5 單克隆抗體腹水的制備 給經(jīng)產(chǎn)BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟，0.5mL/只。1周后，腹腔注射雜交瘤細胞懸液（1～2×106個/mL），0.5mL/小鼠。待小鼠腹部明顯膨大，行動不便時，無菌取腹水，三氯甲烷處理去脂，分裝，－70℃保存。

1.6 單克隆抗體特性的鑒定

1.6.1 染色體計數(shù) 按常規(guī)方法進行，選取SP2/0細胞及雜交瘤細胞，在細胞處于對數(shù)生長期時，向細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入秋水仙素，使其終濃度為0.1μg/mL，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)5h，1 000r/min離心5 min，收集細胞，加入5mL 0.075mol/L KCl進行低滲處理，37℃溫育30min。向細胞懸液中加入固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）1mL，混勻，1 000r/min離心5min。棄上清，加入固定液5mL，將細胞懸浮，室溫靜置30min，1 000r/min離心5min；重復操作1次。加入固定液5mL，懸浮細胞，將細胞懸液滴在預先冰凍的載玻片上，自然擴散，自然干燥。姬姆薩染色液染色，室溫30min，洗掉染色液，自然干燥，顯微鏡下選擇10個細胞形態(tài)完整、單在、染色體分散良好、無重疊、無散失的細胞進行觀察及染色體計數(shù)分析，求出平均染色體數(shù)目。

1.6.2 抗體亞類的測定 采用SBAClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類試劑盒測定，按說明書進行操作。

1.6.3 抗體特異性鑒定 將超速離心的DEV clone－03全病毒行SDS－PAGE，將蛋白轉印至 NC膜，Western blot檢測分泌抗體陽性的細胞株培養(yǎng)上清。用雜交瘤細胞株培養(yǎng)上清作一抗，羊抗鼠HRP－IgG作為二抗，DAB顯色液顯色。

同時采用間接免疫熒光方法檢測雜交瘤細胞分泌上清與病毒感染細胞的特異性反應。將DEV clone－03接種生長良好的CEF單層，當細胞病變達到60%～70%時，棄掉上清，細胞用PBS輕洗3次，加入少量胰酶消化細胞，用PBS將細胞吹下，1 000 r/min離心10min，PBS洗滌1次，制片，自然干燥，冷丙酮4℃固定15min，自然干燥后用PBST洗滌3次，自然干燥。以雜交瘤細胞分泌的上清為一抗，以抗鼠FITC－IgG為二抗（1∶100稀釋），熒光顯微鏡觀察。同時設未感染CEF為對照。

1.6.4 腹水效價的測定 抗DEV VP5單克隆抗體腹水效價用ELISA方法測定。將所獲得的腹水作1∶1×103、1∶2×103、1∶4×103、倍比稀釋至1∶4 096×103，共計12個稀釋倍數(shù)。用已經(jīng)建立的最佳蛋白（VP5－C）包被濃度包被ELISA板，檢測腹水效價。以陽性血清、腹水稀釋液、陰性血清和SP2/0細胞的腹水作對照。具體判定標準為：陰性血清OD值＜0.2，陽性血清OD值＞1.0，檢測樣品OD值＞0.2，P/N＞2.1時腹水的最大稀釋倍數(shù)為腹水的ELISA效價。

2 結果

2.1 雜交瘤細胞株的建立 融合細胞經(jīng)HAT篩選，于融合后3～5d顯微鏡觀察，計數(shù)出現(xiàn)明顯細胞克隆的培養(yǎng)孔，其融合率為84.35%。應用VP5－C蛋白包被ELISA板，用已建立的間接ELISA方法檢測上清，共計獲得4株單克隆抗體。將ELISA和Western blot檢測陽性細胞進行克隆，經(jīng)過3次克隆，所有細胞集落克隆孔檢測為均為陽性，表明獲得了穩(wěn)定分泌的單克隆抗體，將獲得的4株單克隆抗體命名為1B5、3A1、4F9、6F6。

2.2 單克隆抗體特性鑒定

2.2.1 腹水效價的測定 將雜交瘤細胞株注射BALB/c小鼠，制備腹水，用已建立的檢測方法測定腹水的ELISA效價。單克隆抗體1B5、3A1、4F9、6F6腹水ELISA效價分別為1∶2 048×103、1∶512×103、1∶1 024×103、1∶512×103。

2.2.2 雜交瘤細胞染色體分析 隨機選擇細胞形態(tài)完整、染色體分散均勻的10個視野的染色體進行計數(shù)，計算平均數(shù)，得到各雜交瘤細胞染色體平均數(shù)。本研究獲得的雜交瘤細胞株染色體數(shù)目為95～102，均高于小鼠脾細胞染色體數(shù)目（2n＝40）和SP2/0細胞染色體數(shù)目（2n＝62～68），融合后的雜交瘤細胞染色體數(shù)目接近兩種親本之和，表明獲得的分泌抗體的細胞株為小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞融合后的雜交瘤細胞（圖1）。

圖1 雜交瘤細胞株的染色體分析A～D分別為雜交瘤細胞株1B5、3A1、4F9、6F6；E為骨髓瘤細胞SP2/0

2.2.3 單克隆抗體亞類鑒定 采用SBAClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類試劑盒檢測，應用分泌抗體陽性雜交瘤細胞上清檢測單克隆抗體亞類。結果表明，獲得的4株單克隆抗體均為IgG、k鏈抗體。

2.2.4 單克隆抗體特異性鑒定 為了檢測所獲得的單克隆抗體是否特異地針對DEV clone－03VP5蛋白，我們采用Western blot方法檢測雜交瘤細胞分泌上清對全病毒的反應原性，結果表明，獲得的單克隆抗體能夠特異識別DEV clone－03VP5蛋白，大小約為150kDa（圖2）。

應用間接免疫熒光方法，應用雜交瘤細胞分泌上清檢測DEV clone－03，結果表明，單克隆抗體能夠與DEV clone－03發(fā)生抗原抗體反應，能夠識別天然構象的 DEV clone－03VP5蛋白（圖3）。

3 討論

鴨病毒性腸炎傳播迅速，死亡率較高，盡管現(xiàn)有疫苗保護效果較好，但是水禽和候鳥帶毒為本病的清除帶來困難。因此，建立有效的鴨病毒性腸炎檢測方法將對該病的防控提供有效手段。免疫學診斷方法以其特有的優(yōu)勢成為實踐中檢測病原體的常用方法，特異性和準確性直接取決于診斷試劑。而單抗隆抗體純度高、專一性強、重復性好且能在動物體外或體內(nèi)產(chǎn)生同質(zhì)性抗體，以它作為診斷抗體能克服多克隆抗血清診斷時穩(wěn)定性差及特異性低等缺點。

皰疹病毒VP5是較大的病毒衣殼蛋白，其內(nèi)含有多處保守結構域［14］。DEV VP5基因由4 143核苷酸組成，編碼約150kDa蛋白，與HSV－1VP5蛋白大小相似。由于VP5較大，原核表達全長較為困難，因此本研究組對VP5蛋白進行截短表達，并以純化的DEV VP5－C蛋白作為免疫原，制備單克隆抗體，共獲得了4株能夠穩(wěn)定分泌抗DEV VP5特異性抗體的雜交瘤細胞株。在篩選抗體分泌陽性雜交瘤細胞時，應用純化的VP5－C蛋白包被ELISA板，進行ELISA篩選，同時為了排除非特異性雜交瘤細胞的干擾，將ELISA篩選陽性細胞株分泌上清用Western blot方法進行檢測，以DEV全病毒作為抗原，檢測抗體的特異性。本研究對單克隆抗體進行了3次克隆篩選，每次篩選都采用ELISA和Western blot兩種方法進行檢測，確保單克隆抗體的特異性。

本研究對獲得的4株單克隆抗體進行中和活性檢測，結果表明，4株單克隆抗體均不具有中和活性，這可能與衣殼蛋白外包被有囊膜有關，同時也與單克隆抗體所針對的抗原表位在衣殼蛋白中所處位置有關［15］。HSV－1VP5蛋白具有3個功能域，分別為底部、中部和上部功能域［16］，通過比對DEV VP5與HSV－1VP5蛋白，發(fā)現(xiàn)DEV VP5也具有這3個功能域，但是獲得的4株單克隆抗體識別功能域的位置還需要進一步研究證實。單克隆抗體的獲得為進一步研究VP5功能，并確定VP5的B細胞抗原表位提供有效的工具，同時也為下一步探索開發(fā)有效的診斷方法提供基礎。

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