利用核磁共振技術(shù)和電子舌技術(shù)分析2個產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒代謝產(chǎn)物的差異*

胡博然，周妍，朱勇，聞雯，張奉民

1(揚州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚州，225127)2(揚州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州，225009)3(揚州大學(xué)測試中心，江蘇 揚州，225009)

葡萄酒是以鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)全部或部分發(fā)酵釀制而成的，含有一定酒精度的發(fā)酵酒［1］，具有天然的保健作用［2］。目前葡萄酒的質(zhì)量優(yōu)劣依靠國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的酒精度、干浸出物、總酸(滴定酸)、殘?zhí)恰O2、揮發(fā)酸等有限的幾個理化指標(biāo)來評價［3］。而這些指標(biāo)只能反映葡萄酒的健康狀況，并不能充分反映葡萄酒真正的品質(zhì)。因此，建立一種能有效鑒別、分析葡萄酒并能探索葡萄酒內(nèi)在成分差異的方法具有重要的意義。

目前1H NMR與模式識別結(jié)合的方法已經(jīng)應(yīng)用于研究葡萄酒以及一些液態(tài)食品，如油、果汁、綠茶和啤酒等［4－5］。國外有很多實驗證明了此方法科學(xué)可靠，例如 Hong-Seok Son 等［6－7］利用1H NMR 結(jié)合模式識別分析描述不同產(chǎn)區(qū)單品種葡萄和葡萄酒代謝產(chǎn)物的特征以及不同年份葡萄酒代謝產(chǎn)物的差異;Licia Viggiani等［8］利用此方法辨別意大利典型DOC葡萄酒的真實性。電子舌技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛，李華［9］等利用電子舌技術(shù)對昌黎原產(chǎn)區(qū)的干紅葡萄酒進(jìn)行檢測，結(jié)果表明電子舌技術(shù)對昌黎原產(chǎn)區(qū)的不同品種、不同年份的干紅葡萄酒具有明顯的區(qū)分效果。俄羅斯Legin等［10－11］利用電子舌技術(shù)檢測不同品種的葡萄酒和礦泉水，結(jié)果電子舌技術(shù)能區(qū)分所有的樣品。目前利用NMR技術(shù)結(jié)合電子舌技術(shù)對我國原產(chǎn)區(qū)葡萄酒代謝產(chǎn)物的研究還處于空白，因此將其應(yīng)用到我國葡萄酒品質(zhì)分析中具有良好的應(yīng)用前景。

本實驗利用NMR技術(shù)和電子舌技術(shù)來判別分析2個不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒代謝產(chǎn)物的差異，同時優(yōu)化NMR檢測中樣品的預(yù)處理方法并結(jié)合模式識別分析，得到2個不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒的差異并找出對其差異貢獻(xiàn)較大的代謝產(chǎn)物，探索出鑒別不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒的有效方法。

1 材料與方法

試驗于2012年在國家計量認(rèn)證中心揚州大學(xué)測試中心核磁實驗室以及揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院電子舌實驗室進(jìn)行。

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

梅鹿輒(Merlot):2010年份;赤霞珠(Cabernet Sauvignon):2010年份。

沙城產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒、赤霞珠干紅葡萄酒由長城桑干酒莊提供，寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒、赤霞珠干紅葡萄酒由廣夏(銀川)賀蘭山葡萄釀酒有限公司提供。單品種干紅葡萄酒均采用標(biāo)準(zhǔn)釀造工藝，釀造過程中均加入相同的釀酒酵母(Lalvin CY 3079)進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)品質(zhì)量理化指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 15037－2006。

1.1.2 試劑

重水(氘代度 ＞99.9%)、DSS(4，4-二甲基-4-硅代戊磺酸鈉)。

1.1.2 主要儀器

SNL315SV-230冷凍干燥機(美國Thermo公司);AVANCE 600核磁共振波譜儀(德國布魯克公司);TG16A-WS臺式高速離心機(盧湘儀離心機儀器有限公司);電子舌(上海昂申智能科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 核磁樣品預(yù)處理

將沙城產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒干紅葡萄酒按下面2種不同的方法進(jìn)行預(yù)處理，以期探討合適的預(yù)處理方法。

(1)取各單品種干紅葡萄酒在－4℃下，于13 000 r/min 離心10 min，取450 μL 上清液，加入50 μL DSS重水溶液用于定標(biāo)，裝入5 mm核磁管中，進(jìn)行NMR檢測。

(2)取各單品種干紅葡萄酒于3 000 r/min離心10 min，分別取上清液3 mL放入凍干瓶中，－70℃冷凍過夜，然后冷凍干燥，凍干的樣品中加入540 μL D2O，60 μL DSS重水溶液用于定標(biāo)，13 000 r/min 離心10 min，取上清液 500 μL，裝入 5 mm 核磁管中，進(jìn)行NMR檢測。

1.2.2 NMR圖譜測定

葡萄酒一維NMR譜圖的實驗條件為:溫度298 K，采用1H{13C/15N}探頭，1H共振頻率 600.13 MHz，1C共振頻率譜寬7 183.9 Hz，采樣點數(shù)32 K，采樣時間2.3 s，混和時間100 ms，譜線加寬因子為0.3 Hz。先不壓制水峰，按照常規(guī)實驗采樣8次，然后采用Noesygppr1d脈沖序列壓制水峰，采樣次數(shù)256次。

1.2.3 NMR數(shù)據(jù)預(yù)處理

利用600 MHz譜儀上的AMIX軟件將譜圖按0.005 ppm進(jìn)行分段積分，將4.96～4.8 ppm的殘余水峰，1.22～1.18 ppm和3.72～3.57 ppm的殘余乙醇峰，0～0.5 ppm、1.84～1.74 ppm 和 2.95～2.90 ppm的DSS峰的數(shù)據(jù)去除，不進(jìn)行積分。數(shù)據(jù)歸一化處理后，代入SIMCA－P 12.0軟件用于模式識別分析。

1.2.4 電子舌的檢測方法

對每個酒樣進(jìn)行檢測時，均未對樣品進(jìn)行任何前處理。隨機選擇酒樣，搖晃均勻，開瓶倒取20 ml于電子舌專用樣品杯中，在常溫下進(jìn)行檢測，每個酒樣重復(fù)檢測3次，不同樣品間采用3.5 mol/L的KCl溶液對電極進(jìn)行清洗。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

將核磁數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 12.0軟件進(jìn)行模式識別分析，采用最常用的多元統(tǒng)計方法PCA和PLS-DA進(jìn)行分析。對樣品進(jìn)行分類，同時找出對分類有貢獻(xiàn)的生物標(biāo)志物［12－13］。

PCA模型可以得到得分圖，從而獲得樣品分類的信息。模型的驗證主要參考R2、Q2等參數(shù)。R2是所解釋的模型差異，Q2是所預(yù)測的模型差異。理論上說R2、Q2數(shù)值越接近1說明建立的模型越好［14］。

PLS-DA只需要一個數(shù)據(jù)集X，但在分析時必須對樣品進(jìn)行指定并分組，這樣分組后模型自動加上另外一個隱含的數(shù)據(jù)集Y，其他原理與PCA相同。這種模型計算的方法有利于發(fā)現(xiàn)組間的異同點，也可以對未知的樣本進(jìn)行預(yù)測［14］。

利用電子舌儀器上的主成分分析軟件對電子舌檢測的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

1.4 計算公式

代謝產(chǎn)物的含量可以通過一維1H-NMR譜中待測物質(zhì)某一指定基團(tuán)上質(zhì)子引起的峰面積與加入的內(nèi)標(biāo)物DSS指定基團(tuán)上的質(zhì)子產(chǎn)生的峰面積之比換算得到，代謝產(chǎn)物的質(zhì)量濃度u(g/L)的計算公式如下所示:

其中:AS為被測樣品選定信號的積分面積;nS為樣品被積分信號包含的質(zhì)子數(shù);MS為被測樣品的相對分子質(zhì)量;AR為內(nèi)標(biāo)DSS選定信號的積分面積;nR為內(nèi)標(biāo)DSS被積分信號包含的質(zhì)子數(shù);MR為內(nèi)標(biāo)DSS的相對分子質(zhì)量;mR為內(nèi)標(biāo)DSS的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 NMR技術(shù)分析

2.1.1 不同預(yù)處理條件下干紅葡萄酒1H NMR譜圖的比較

由于葡萄酒中水分和乙醇含量相對較高，在1H NMR譜圖中共振信號較強，從而會對低含量物質(zhì)的信號產(chǎn)生掩蔽效果。凍干預(yù)處理可以減少葡萄酒中水和乙醇的含量，所以本實驗探討了凍干與不凍干的預(yù)處理方法，來尋求合適的預(yù)處理方法。圖1和圖2分別為未凍干與凍干預(yù)處理的梅鹿輒干紅葡萄酒的譜圖，通過圖1與圖2的對比，可以看出圖1中主要的信號是乙醇和水，微量物質(zhì)的信號相對比較微弱，而圖2中乙醇和水的信號明顯減弱，微量物質(zhì)的峰信號如甘油、脯氨酸、琥珀酸、2，3-丁二醇等清晰可辨。由此可見凍干不僅可以抑制水和乙醇的信號，對樣品也起到濃縮的作用，使譜圖中含量比較低的組分得以辨識。

圖1 未進(jìn)行凍干處理的梅鹿輒干紅葡萄酒1H NMR譜圖Fig.1 1H NMR spectrum of the unlyophilized Merlot dry red wine

圖2 進(jìn)行凍干處理的梅鹿輒干紅葡萄酒1H NMR譜圖Fig.2 1H NMR spectrum of the lyophilized Merlot dry red wine

2.1.2 不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒的模式識別分析

通過NMR方法得到的譜圖信息很復(fù)雜，采用常規(guī)統(tǒng)計分析方法難以發(fā)現(xiàn)樣品之間或各組之間的異同。如今在化學(xué)計量學(xué)方法中，解決復(fù)雜體系中歸類問題以及標(biāo)記物搜索的主要手段是模式識別分析。目前，NMR指紋譜與模式識別相結(jié)合已經(jīng)廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域［15－16］。

將干紅葡萄酒樣品的核磁檢測數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP 12.0軟件中進(jìn)行主成分分析。經(jīng)凍干處理后不同產(chǎn)區(qū)2010年份的梅鹿輒、赤霞珠干紅葡萄酒建立PCA得分圖如圖3所示，累積貢獻(xiàn)率R2X=0.853，Q2=0.728，主成分1(PC1)占總變量的45.9%，主成分2(PC2)占16.4%。通過PC1方向可以看出干紅葡萄酒在河北沙城、寧夏賀蘭山東麓這2個產(chǎn)區(qū)間的分離比較清晰，說明不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒的代謝產(chǎn)物存在顯著的差異性，但河北沙城產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒與赤霞珠干紅葡萄酒之間區(qū)分不明顯。

圖3 不同產(chǎn)區(qū)的干紅葡萄酒1H NMR譜的PCA得分圖Fig.3 PCA scores plot derived from the 1H NMR spectra of the lyophilized dry red wines(Merlot and Cabernet Sauvignon)from different regions

在PCA基礎(chǔ)上，將干紅葡萄酒進(jìn)行分類后，進(jìn)行PLS-DA分析，圖4是經(jīng)凍干處理后不同產(chǎn)區(qū)2010年份的梅鹿輒、赤霞珠干紅葡萄酒建立的PLS-DA得分圖，累積貢獻(xiàn)率 R2X=0.893，R2Y=0.979，Q2=0.91，PC1占45.9%，PC2占14.7%，模型的適應(yīng)性與可預(yù)測性良好，通過PC1方向可以看出2個產(chǎn)區(qū)的干紅葡萄酒明顯區(qū)分開來。PLS-DA得分圖與PCA得分圖相比，PLS-DA得分圖中同一產(chǎn)區(qū)品種間的區(qū)分比較明顯，并且同一品種間的離散程度有所減少，為了形象的描述兩個產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒代謝產(chǎn)物的細(xì)微差異，最終選擇PLS-DA模型進(jìn)行兩兩分析。

2.1.3 不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒代謝產(chǎn)物的比較

將不同產(chǎn)區(qū)同種干紅葡萄酒進(jìn)行PLS-DA比較，通過載荷圖可找到引起產(chǎn)區(qū)之間差異的代謝產(chǎn)物。在建模過程中通過正交信號校正(Orthogonal Signal Correction，OSC)過濾掉與分類信息無關(guān)的信息［17］。

圖4 凍干處理的不同產(chǎn)區(qū)的干紅葡萄酒1H NMR譜的PLS-DA得分圖Fig.4 PLS-DA scores plot derived from the 1H NMR spectra of the lyophilized dry red wines(Merlot and Cabernet Sauvignon)from different regions.

對寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)與河北沙城產(chǎn)區(qū)2010年份的梅鹿輒干紅葡萄酒建立PLS-DA得分圖如圖5所示，累積貢獻(xiàn)率 R2X=0.733，R2Y=0.996，Q2=0.929(PC1/PC2占73.3%)，通過PC1方向可以看出寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)與河北沙城產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒干紅葡萄酒之間有明顯的區(qū)分，表明不同產(chǎn)區(qū)2010年份的梅鹿輒干紅葡萄酒間代謝產(chǎn)物存在顯著的差異性。

圖5 凍干處理的不同產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒干紅葡萄酒1H NMR譜的PLS-DA得分圖Fig.5 PLS-DA score plot from the1H NMR spectra of the lyophilized Merlot dry red wines from different regions.

對寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)與河北沙城產(chǎn)區(qū)2010年份的梅鹿輒葡萄酒建立如圖6所示的PLS-DA載荷圖，載荷圖上部區(qū)域處于較高峰表示其對應(yīng)的代謝產(chǎn)物在寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)梅鹿輒干紅葡萄酒中含量較高，較低則表示其含量低。從載荷圖中可以看出，與沙城產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒干紅葡萄酒中代謝產(chǎn)物相比，寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒干紅葡萄酒中甘油、琥珀酸、脯氨酸、纈氨酸、乙酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖含量較高，而2，3-丁二醇、乳酸、α-D-葡糖醛酸、酒石酸、膽堿、乙酸乙酯、沒食子酸含量較低。

圖6 凍干處理的不同產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒干紅葡萄酒1H NMR譜的PLS-DA載荷圖Fig.6 PLS-DA loading plot derived from the1H NMR spectra of the lyophilized Merlot dry red wines from different regions.

寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)與河北沙城產(chǎn)區(qū)2010年份的赤霞珠葡萄酒建立如圖7所示的PLS-DA得分圖，累積貢獻(xiàn)率 R2X=0.701，R2Y=0.997，Q2=0.98(PC1/PC2占70.1%)，通過PC1方向可以得到寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)與河北沙城產(chǎn)區(qū)的赤霞珠干紅葡萄酒之間有明顯的差異，表明不同產(chǎn)區(qū)2010年份的赤霞珠干紅葡萄酒間代謝產(chǎn)物有明顯的差異。

圖7 凍干處理的不同產(chǎn)區(qū)的赤霞珠干紅葡萄酒1H NMR譜的PLS-DA得分圖Fig.7 PLS-DA score plot from the1H NMR spectra of the lyophilized Cabernet Sauvignon dry red wines from different regions.

寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)與河北沙城產(chǎn)區(qū)2010年份的赤霞珠干紅葡萄酒建立PLS-DA載荷圖如圖8所示，載荷圖上部區(qū)域較高的峰表示其對應(yīng)的代謝產(chǎn)物在寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)赤霞珠干紅葡萄酒中含量較高，較低則表示含量低。從載荷圖中可以得到，與沙城產(chǎn)區(qū)的赤霞珠葡萄酒中代謝產(chǎn)物相比，寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的赤霞珠葡萄酒中甘油、琥珀酸、纈氨酸含量較高，而2，3-丁二醇、乳酸、乙酸乙酯、乙酸、蔗糖、酒石酸、脯氨酸、膽堿、沒食子酸含量較低。

圖8 凍干處理的不同產(chǎn)區(qū)的赤霞珠干紅葡萄酒1H NMR譜的PLS-DA載荷圖Fig.8 PLS-DA loading plot derived from the1H NMR spectra of the lyophilized Cabernet Sauvignon dry red wines from different regions.

通過對同一品種、不同產(chǎn)區(qū)2010年份干紅葡萄酒代謝產(chǎn)物的對比，得出與河北沙城產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒干紅葡萄酒相比，寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒干紅葡萄酒中甘油、琥珀酸、脯氨酸、纈氨酸、乙酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖含量較高，乳酸，2，3-丁二醇、膽堿、α-D-葡糖醛酸、乙酸乙酯、酒石酸、沒食子酸含量較低;赤霞珠干紅葡萄酒中甘油、琥珀酸、纈氨酸含量較高，2，3-丁二醇、脯氨酸、乳酸、乙酸、蔗糖、乙酸乙酯、酒石酸、α-D-葡糖醛酸、膽堿、沒食子酸含量較低。

2個不同產(chǎn)區(qū)2010年份的梅鹿輒、赤霞珠干紅葡萄酒在代謝產(chǎn)物組成成分方面區(qū)別不大，導(dǎo)致其差異的是代謝產(chǎn)物的含量。對2個產(chǎn)區(qū)2010年份干紅葡萄酒中主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行絕對定量分析，代謝產(chǎn)物的含量可以通過一維1H-NMR譜中待測物質(zhì)某一指定基團(tuán)上質(zhì)子引起的峰面積與加入的內(nèi)標(biāo)物DSS指定基團(tuán)上的質(zhì)子產(chǎn)生的峰面積之比換算得到。圖9顯示了干紅葡萄酒中8種代表性代謝產(chǎn)物含量的差異，其結(jié)果與PLS-DA的分析結(jié)果一致。

2.2 電子舌技術(shù)分析

2.2.1 不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒的PCA分析

電子舌檢測的是葡萄酒代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出來的整體特征，樣品不需要預(yù)處理。對葡萄酒樣品進(jìn)行電子舌技術(shù)檢測后，建立如圖9所示的PCA得分圖。從圖中可以看出檢測所用的干紅葡萄酒大量的原始信息壓縮到了主成分1和主成分2中，占原始信息量的75.1%，并且主要信息集中在主成分1上。結(jié)果顯示電子舌對不同產(chǎn)區(qū)2010年份干紅葡萄酒代謝產(chǎn)物之間的差異性有明顯的區(qū)分效果。

3 討論

本實驗利用NMR技術(shù)和電子舌技術(shù)結(jié)合模式識別分析方法，得到2個不同產(chǎn)區(qū)的干紅葡萄酒代謝產(chǎn)物之間有顯著的差異，同時找出對分類有貢獻(xiàn)的代謝產(chǎn)物。

3.1 多元醇

甘油和2，3-丁二醇是葡萄酒重要的呈味成分，含量僅次于乙醇。2，3-丁二醇是酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物，通常情況下不影響酒精飲料的感官質(zhì)量，它使葡萄酒略微帶有苦味［18－19］。本實驗中與沙城產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒、赤霞珠干紅葡萄酒相比，寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒、赤霞珠干紅葡萄酒中2，3-丁二醇含量相對較低。

甘油對葡萄酒的質(zhì)量有重要的貢獻(xiàn)，影響葡萄酒的口感和質(zhì)地，使葡萄酒具有粘稠感和甜味［18－19］。本實驗中寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的赤霞珠、梅鹿輒干紅葡萄酒中的甘油含量相對沙城產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒、赤霞珠干紅葡萄酒較高，由于葡萄酒在釀造過程中條件如亞硫酸鹽濃度、發(fā)酵溫度、酵母菌是相同的，因此本實驗干紅葡萄酒間甘油含量不同是由寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)赤霞珠、梅鹿輒葡萄漿果中糖分不同引起的。

3.2 有機酸

酒石酸是葡萄帶進(jìn)葡萄酒中最主要的酸類物質(zhì)，漿果中的酒石酸含量主要與果實的成熟度有關(guān)，酒石酸在葡萄酒的陳釀過程中會以酒石酸氫鉀和酒石酸鈣的形式沉淀下來，所以通常酒石酸不用來作為葡萄酒特征代謝產(chǎn)物。

琥珀酸是重要的非揮發(fā)性有機酸，它是酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，影響總酸度。但琥珀酸很穩(wěn)定，在陳釀的過程中不發(fā)生變化［20－21］。本實驗中寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒、赤霞珠干紅葡萄酒的琥珀酸含量相對較高。

葡萄酒中的乳酸含量相對很高，幾乎觀察不到蘋果酸的存在，說明干紅葡萄酒都經(jīng)過了蘋果酸-乳酸發(fā)酵，將蘋果酸轉(zhuǎn)變成乳酸或其他物質(zhì)，這也解釋了干紅葡萄酒中不含有蘋果酸的原因。

3.3 氨基酸

葡萄酒中的氨基酸有很多來源。一些是葡萄漿果中固有的，在發(fā)酵后期部分或全部被酵母菌代謝，或者是從死酵母中釋放出來，還有一些是由酶降解葡萄中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的。脯氨酸不是酵母菌的營養(yǎng)物質(zhì)，因此可以用來作為葡萄酒的生物標(biāo)記物。Jang-Eun Lee等［19］認(rèn)為，葡萄酒中脯氨酸的含量取決于環(huán)境因素和葡萄品種。除了脯氨酸之外，通過PLS-DA分析找出的另一種氨基酸類生物標(biāo)記物為纈氨酸。葡萄酒中的纈氨酸在發(fā)酵時被酵母菌利用，而又隨著酵母菌的自溶而再現(xiàn)。

3.4 糖類

葡萄糖與果糖是葡萄中主要的糖類。在葡萄成熟期開始的時候，葡萄中的葡萄糖含量比果糖高，到了采收期兩者的含量幾乎持平。本實驗找出的糖類主要是蔗糖、α-葡萄糖和β-葡萄糖，2個不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒間這3種糖的濃度差異很小，因此糖類不能作為葡萄酒的特征代謝產(chǎn)物。

3.5 膽堿

膽堿是甜菜堿的前體，是一種水溶性的必需營養(yǎng)物質(zhì)。在本實驗中，膽堿是區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒的一個標(biāo)志，與沙城產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒、赤霞珠干紅葡萄酒相比，寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的梅鹿輒、赤霞珠干紅葡萄酒中膽堿的含量相對較低。但膽堿含量與葡萄酒產(chǎn)區(qū)之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

圖9 干紅葡萄酒中主要代謝產(chǎn)物含量比較Fig.9 The content comparison of main metabolites in dry red wines.

圖10 不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒的PCA得分圖Fig.10 PCA scores plot derived from dry red wines made in different regions.

4 結(jié)論

本實驗以2個產(chǎn)區(qū)2010年份的梅鹿輒、赤霞珠干紅葡萄酒為樣品，基于核磁共振技術(shù)，建立一套可行的樣品預(yù)處理、核磁共振檢測和數(shù)據(jù)分析的干紅葡萄酒分析方法;基于電子舌技術(shù)，提供了一種簡單快速、對樣品無損的干紅葡萄酒檢測方法。

(1)凍干處理可去除樣品中大部分的水分和乙醇，樣品濃縮后微量物質(zhì)的信號增強，使獲取的1H NMR譜圖信息豐富，有利于代謝產(chǎn)物的差異分析，因此對于1H NMR而言，葡萄酒樣品進(jìn)行凍干處理后識別效果更好。

(2)通過模式識別分析能夠較好地將不同產(chǎn)區(qū)的干紅葡萄酒區(qū)分開，所建立的模型的準(zhǔn)確性和預(yù)測性均很高。與河北沙城產(chǎn)區(qū)2010年份的干紅葡萄酒相比，寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)2010年份的梅鹿輒干紅葡萄酒中甘油、琥珀酸、脯氨酸、纈氨酸、乙酸含量較高，乳酸、2，3-丁二醇、膽堿、乙酸乙酯、沒食子酸含量較低;2010年份的赤霞珠干紅葡萄酒中甘油、琥珀酸、纈氨酸含量較高，2，3-丁二醇、脯氨酸、乳酸、乙酸、乙酸乙酯、膽堿、沒食子酸含量較低。同時對2個產(chǎn)區(qū)的2010年份的干紅葡萄酒中主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行絕對定量分析，其結(jié)果與PLS-DA的分析結(jié)果一致。下一步可對這2個產(chǎn)區(qū)不同年份的干紅葡萄酒進(jìn)行檢測分析，有利于深入探討造成這2個產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒間差異的主要代謝產(chǎn)物，為葡萄酒品質(zhì)評價以及鑒別提供理論依據(jù)。

(3)核磁共振技術(shù)對樣品進(jìn)行預(yù)處理時，凍干預(yù)處理在去除樣品中的水與乙醇的同時，也使部分揮發(fā)性成分(如酸、酯、高級醇等物質(zhì))被去除，樣品有所損失。而電子舌技術(shù)能夠獲取葡萄酒液體樣本的味覺特征的總體信息，樣品不需要進(jìn)行預(yù)處理，具有高靈敏度、可靠性、重復(fù)性的特點，為快速分析不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒的品質(zhì)提供一種便捷的方法。

(4)核磁共振技術(shù)和電子舌技術(shù)結(jié)合模式識別分析方法得到的結(jié)論相吻合，兩者相互驗證，說明不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒間代謝產(chǎn)物存在明顯的差異。

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