Egr-1誘騙性寡脫氧核苷酸對(duì)大鼠動(dòng)脈損傷后PCNA和CDK4表達(dá)的影響

河北省邯鄲市中心醫(yī)院心內(nèi)科（邯鄲056001） 王泰然 馬 巍 宋文奇

心血管疾病是目前世界上引起人類死亡的主要疾病之一。其中，冠心?。–oronary artery Disease，CAD）是最重要的因心血管疾病死亡的根本原因。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（Percutaneous coronary intervention，PCI）方法在過(guò)去的20年中發(fā)展得非常迅速，已經(jīng)成為治療CAD的重要手段。然而，血管成形術(shù)后再狹窄（Restenosis，RS）的出現(xiàn)，仍然是影響其中長(zhǎng)期療效的重要因素。RS的本質(zhì)特征是血管損傷后，血管中膜平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cell，VSMC）向內(nèi)膜下的遷移、增殖以及產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)。近3年來(lái)，藥物涂層支架的應(yīng)用，明顯降低了術(shù)后再狹窄率＜1 0%，但涂層支架的使用也存在較大問(wèn)題：在抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的同時(shí)也抑制了血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，使內(nèi)皮層愈合延遲，不利于內(nèi)皮細(xì)胞功能的改善［1，2］。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因治療再狹窄可能是一種很有前景的治療方法［3］。早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1（Early growth response factor-1，Egr-1）是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TF），調(diào)控著多種增殖相關(guān)基因的表達(dá)［4，5］。在外源性刺激時(shí)Egr-1表達(dá)增多，促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管內(nèi)膜增生，導(dǎo)致RS等病理性血管修復(fù)反應(yīng)，抑制其表達(dá)能夠有效防止VSMC的異常增生，從而達(dá)到治療疾病的目的［6］。人們?nèi)諠u關(guān)注以TF為靶點(diǎn)在核轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行阻斷的基因干預(yù)治療方法［7］。其中誘騙寡脫氧核苷酸（Decoy oligodeoxynucleotides，Decoy-ODNs）技術(shù)是將與TF靶相結(jié)合位點(diǎn)（順式作用元件）序列相同的人工合成雙鏈寡脫氧核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，競(jìng)爭(zhēng)性誘騙TF與其結(jié)合，使TF所調(diào)控的能促進(jìn)細(xì)胞增殖的下游基因表達(dá)受抑，從而在轉(zhuǎn)錄水平上達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的目的［8］。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察Egr1Decoy-ODN對(duì)球囊損傷后大鼠血管Egr-1增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDK4）表達(dá)的影響，來(lái)探討Decoy ODN防治RS的作用機(jī)制，為實(shí)際應(yīng)用Decoy-ODN防治RS提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性Wistar大白鼠，體質(zhì)量350～400g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（京）2006-0009。

1.2 主要儀器與試劑：2FFogarty導(dǎo)管（美國(guó)Baxter health corporation），倒置顯微鏡（日本OLYMPU S），手動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)Lecia RM 2235Lecia），醫(yī)學(xué)圖像照相系統(tǒng)（日本Olympus BX51），醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus DP2-BSW），手術(shù)器材：剪刀，血管夾，止血鉗，手術(shù)縫針及縫線，注射器等，小型臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)SIGMA1-13），紫外分光光度計(jì)（日本UV-3000），實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀：（美國(guó)ABI PRISM R7500Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems）。轉(zhuǎn)染試劑FuGene6（瑞 士Ro c h e公 司），Egr-1兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司），CDK4兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司），PCNA兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司），Decoy-ODN（大連寶生物工程有限公司），總RT-PCR提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司）RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司），RT-PCR引物（寶生物工程大連有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠頸動(dòng)脈損傷的模型制作：健康雄性Wistar大鼠96只，體重350～400g。10%水合氯醛（300mg／kg）麻醉后，頸正中切開(kāi)，暴露左頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，用血管夾暫時(shí)阻斷左頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，用2F導(dǎo)管從頸外動(dòng)脈插入向前推進(jìn)至主動(dòng)脈弓，推入生理鹽水充盈氣囊，沿頸總動(dòng)脈全長(zhǎng)回撤，然后抽癟氣囊。這個(gè)過(guò)程重復(fù)三次，且每次回撤時(shí)導(dǎo)管旋轉(zhuǎn)90度。造成左頸總動(dòng)脈內(nèi)膜損傷。術(shù)后結(jié)扎頸外動(dòng)脈，恢復(fù)血流，縫合頸部創(chuàng)口。局部使用青霉素以預(yù)防感染，喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。

2.2 分組及處理：96只雄性Wistar大白鼠隨機(jī)分為4組，每組24只。假手術(shù)組：只進(jìn)行頸動(dòng)脈結(jié)扎，但不插入導(dǎo)管，即不造成動(dòng)脈內(nèi)膜損傷。單純損傷組：球囊拉傷左頸總動(dòng)脈。SCR組：球囊拉傷左頸總動(dòng)脈后局部注入200μl含有500μg SCR-ODN、30μl轉(zhuǎn)染試劑FuGene6的1mM MgCl2液。Decoy-ODN+Fu-Gene6治療組：球囊拉傷左頸總動(dòng)脈后，應(yīng)用微量注射器局部釋放200μl含有500μg FITC標(biāo)記的decoy ODN、30μl轉(zhuǎn)染試劑FuGene6的lmM MgCl2溶液，使其在局部作用20min。

2.3 Egr-1誘騙及誘騙對(duì)照寡脫氧核苷酸（Decoy-ODNs和Decoy-ODNs SCR）的設(shè)計(jì)合成：Egr-1的誘騙寡脫氧核苷酸（decoy ODNs）基因序列為：上游5'-TCGCCCTCGCCCCCGCTAAGGG-3'，下游3'-AGCGGGGGCGGGGG-CGATTCCC-5'。Egr-1的誘騙對(duì)照寡脫氧核苷酸（Decoy ODNs SCR）基因序列為：同誘騙序列類似的錯(cuò)配雙鏈寡脫氧核苷酸，上游5'-AGCCGCACCGGC-CTGCCTCGTC-3'，下游3'-TCGGCGTGGCCGGACGGAGCAG-5'。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳法純化并凍干保存，在其3'和5'端進(jìn)行硫代修飾，部分寡核苷酸的5'端用FITC標(biāo)記，以便于在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后基因的分布情況。

2.4 在體Decoy ODN轉(zhuǎn)染：室溫下分別將500μg Decoy-ODNs與30μl轉(zhuǎn)染試劑FuGene6充分混合成復(fù)合物后溶于170μl的lmm MgCl2液中，在制作血管球囊損傷模型的同時(shí)，從頸外動(dòng)脈將混合液局部注入至損傷的血管節(jié)段內(nèi)。在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。于轉(zhuǎn)染24h后處死大鼠2只，立即取治療局部的血管放入液氮罐中，經(jīng)制成冰凍切片（片厚5μm）后，避光于熒光顯微鏡下觀察。

2.5 血管標(biāo)本的病理學(xué)檢查：各組血管用石蠟包埋后，從每段血管的橫截面隨機(jī)切下3張切片（片厚5μm），HE染色，光鏡顯微鏡下觀察血管內(nèi)膜增生情況，并應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件進(jìn)行圖象分析，每個(gè)標(biāo)本間隔取3張切片，用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件測(cè)量，計(jì)算出內(nèi)膜面積、中膜面積、管腔面積和內(nèi)膜與中膜（I／M）的面積比。圖像分析由操作熟練但不知情者操作。

2.6 Real time RT-PCR法檢測(cè)血管壁組織的Egr-1、PCNA和CDK4mRNA表達(dá)：采用Trizol一步法提取血管組織總RNA，取各組總RNA3μl逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，反應(yīng)總體積為20μl，反應(yīng)條件為37℃15min，85℃5s，4℃7min。以2μg cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為20μl，2μl 的 cDNA，10μl 的SYBRRPremix Ex TaqTM，0.4μl的引物和7.2μl的超純水。主要的循環(huán)參數(shù)如下：1個(gè)循環(huán)的預(yù)變性（95°C 30s），40個(gè)循環(huán)的退火（95°C 5s）和延伸（60°C 34s）。Egr-1上游引物5'-CCCAAACT- GGAGGAGATGA-3'，下游引物5'-GAGGCAGAGGAAGACGATG-3'。PCNA上游引物5'-GGGGTGAAGTTTTCTGCGAG-3'，下游引物 5'-CGATCTTGGGA-GCCAAATAATAC-3'。CDK4上 游引物5'-CCAGGACCTACGGACATA-3'，下游引物5'-TACAGCCAACACTCCACAT-3'。β-actin上游引物5'-CGTGCGTGA-C ATTAAAGAG-3'，下游引物5'-TTGCCGATAGTGATGACCT-3'。β-actin作為每個(gè)樣品的內(nèi)參。每個(gè)目的基因的CT平均值減去對(duì)應(yīng)模板的內(nèi)參照基因的CT平均值，得到△CT，根據(jù)公式：△CT（樣本）＝目的組基因CT-對(duì)照基因內(nèi)參CT；△CT（對(duì)照）＝對(duì)照組基因CT-對(duì)照基因內(nèi)參CT；△△CT＝△CT（樣本）-△CT（對(duì)照）；因此樣本目的基因的相對(duì)表達(dá)量＝2-△△CT［9］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 采用Western blot法檢測(cè)血管壁組織的Egr-1、CDK4和PCNA的蛋白表達(dá)：提取各組動(dòng)脈總蛋白，將含有50μg總蛋白的樣品用SDSPAGE分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。脫脂奶粉封閉過(guò)夜，用TBS液清洗兩遍，然后加入1∶400稀釋的一抗（Egr-1、PCNA和CDK4）中室溫下孵育2h。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記一抗，化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)。凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶的平均積分光密度值，記錄結(jié)果。以β-actin蛋白表達(dá)為內(nèi)參照，目的蛋白和β-actin條帶平均積分光密度比值表示目的蛋白的相對(duì)含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有的檢測(cè)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用LSD法，當(dāng)P＜0.05，結(jié)果被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 在體轉(zhuǎn)染效果觀察 轉(zhuǎn)染24h后，收集血管標(biāo)本，然后在470～490nm的熒光顯微鏡下觀察，以確定轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染Egr-1decoy ODN基因24h后，可見(jiàn)血管內(nèi)膜和中膜有大量綠色熒光分布，證明轉(zhuǎn)染成功（圖1）。

圖1 Decoy-ODN轉(zhuǎn)染后24h，可見(jiàn)殘存內(nèi)膜及中膜大量綠色熒光分布（×100）

2 血管病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果 假手術(shù)組，血管內(nèi)膜由一層完整的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，無(wú)內(nèi)膜增生，管腔無(wú)狹窄；大鼠頸總動(dòng)脈拉傷后3d，可見(jiàn)內(nèi)皮剝脫，無(wú)新生內(nèi)膜增生，管腔無(wú)狹窄，說(shuō)明球囊拉傷動(dòng)脈模型成功；單純損傷組和SCR組7d時(shí)可見(jiàn)內(nèi)膜增生，管腔狹窄，14d、2ld時(shí)內(nèi)膜增生更明顯，內(nèi)膜及中膜層有大量的增生細(xì)胞，排列紊亂，內(nèi)彈力板模糊，管腔明顯狹窄。Decoy-ODN組與同一時(shí)間點(diǎn)單純損傷組和SCR組相比，內(nèi)膜增生受到抑制（圖2），差異有顯著性（P＜0.01，見(jiàn)附表）。

圖2 I為新生內(nèi)膜，M為中膜，IEL為內(nèi)彈力板，黑色線段表示新生內(nèi)膜厚度。

附表 Egr-1decoy ODN對(duì)球囊損傷后新生內(nèi)膜增生的影響（±s，n＝24）

附表 Egr-1decoy ODN對(duì)球囊損傷后新生內(nèi)膜增生的影響（±s，n＝24）

注：LA為管腔面積，I為新生內(nèi)膜面積，M為中膜面積，I／M為內(nèi)膜面積與中膜面積比值。與同一時(shí)間點(diǎn)的injury-only組和SCR組比較★P＜0.01，＃P＜0.01；與同一時(shí)間的假手術(shù)組、injury-only組和SCR組比較▲P＞0.05。面積單位：μm2。

組 別 指標(biāo)7d 14d 21d Sham LA 0.481±0.030 0.483±0.014 0.485±0.035 I ---M 0.136±0.013 0.128±0.025 0.134±0.017 I／M - - -injury-only LA 0.413±0.007 0.391±0.025 0.300±0.028 I 0.092±0.013 0.123±0.024 0.215±0.020 M 0.137±0.008 0.134±0.011 0.130±0.005 I／M 0.673±0.105 0.919±0.159 1.682±0.126 SCR LA 0.400±0.022 0.385±0.010 0.289±0.012 I 0.101±0.023 0.128±0.012 0.229±0.018 M 0.140±0.015 0.129±0.007 0.133±0.009 I／M 0.709±0.113 0.991±0.009 1.732±0.159 Decoy LA 0.461±0.023＃ 0.441±0.022＃ 0.440±0.015＃I 0.044±0.007＃ 0.055±0.016＃ 0.073±0.016＃M 0.134±0.019▲ 0.130±0.023▲ 0.136±0.021▲I／M 0.335±0.048★ 0.427±0.123★ 0.543±0.153★

3 血管壁Egr-1、PNCA和CDK4mRNA表達(dá)結(jié)果 假手術(shù)組大鼠動(dòng)脈Egr-1、PCNA CDK4mRNA的表達(dá)微弱，血管球囊損傷后Egr-1、PCNA和CDK4 mRNA的表達(dá)增加，Egr-1的表達(dá)高峰在21d，單純損傷組和SCR組表達(dá)分別是假手術(shù)組的18.05±1.22倍和18.38±1.57倍，PCNA mRNA的高峰在7d，單純損傷組和SCR組表達(dá)分別是假手術(shù)組的6.28±0.64倍和6.58±0.62倍；CDK4mRNA的高峰在7d，單純損傷組和SCR組表達(dá)分別是假手術(shù)組的4.92±0.40倍和5.28±0.43倍，經(jīng)Decoy-ODN治療后，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Egr-1、PCNA和CDK4mRNA的表達(dá)明顯減少，與單純損傷組和SCR組比較有顯著差異（P＜0.001）

圖3 Egr-1Decoy-ODN對(duì)Egr-1、PCNA和CDK4mRNA的表達(dá)的影響。

4 Western blot檢測(cè)血管壁Egr-1、PCNA和CDK4表達(dá)結(jié)果 假手術(shù)組Egr-1和CDK4蛋白微弱表達(dá)，血管球囊損傷后Egr-1和CDK4的表達(dá)同其mRNA的表達(dá)類似。Egr-1的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增高，在21d，免疫印跡帶達(dá)到最強(qiáng)；而CDK4免疫印跡帶的最強(qiáng)度為7d，Decoy-ODN治療組，蛋白表達(dá)較SCR組和對(duì)照組相比顯著減弱（圖4）。

討 論

PCI是治療冠心病的重要手段，然而PCI術(shù)后的再狹窄卻嚴(yán)重影響其遠(yuǎn)期療效［10］。近年來(lái)，對(duì)其發(fā)生機(jī)制及防治的研究一直是研究的熱點(diǎn)。目前對(duì)PCI術(shù)后再狹窄的治療研究已經(jīng)深入到基因水平。近期的研究發(fā)現(xiàn)有多種核TF（包括Egr-1）調(diào)控著VSMC增殖相關(guān)基因的表達(dá)，通過(guò)干預(yù)這些TF的轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程能夠抑制VSMC增殖，達(dá)到抑制球囊損傷后內(nèi)膜過(guò)度增生和RS的目的［11，12］。TF是一類DNA結(jié)合蛋白，它與基因啟動(dòng)子中特定序列（即順式作用元件）相結(jié)合而調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［13］。

圖4 Western blot法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組血管組織目的蛋白表達(dá)變化

Egr-1是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，在正常血管壁中低水平表達(dá)或不表達(dá)，而在動(dòng)脈損傷和其它多種刺激可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cell，VSMC）及內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，誘導(dǎo)VSMC的分裂、增殖和內(nèi)膜增生［14］。SANTIAGO等［15］利用Egr-1反義核苷酸成功地抑制了動(dòng)脈損傷后Egr-1在VSMC中的表達(dá)及VSMC增殖。這表明Egr-1在VSMC的增殖過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。因此干預(yù)Egr-1轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)，以抑制VSMC增殖，減輕內(nèi)膜增生，可能為再狹窄防治策略的制定提供了新的思路和選擇。

TF誘騙策略是一種針對(duì)TF的在核轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默治療方法。TF Decoy-ODNs能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合活化的TF序列特異識(shí)別結(jié)構(gòu)域，快速有效的抑制TF與啟動(dòng)子調(diào)控序列的特異性結(jié)合，從而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄起始［13］。常用的Decoy-ODNs為小分子的雙鏈DNA，與反義ODNs相比有許多優(yōu)點(diǎn)，如雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；分子量小，易于合成；具有特異性的靶向結(jié)合位點(diǎn)；能抑制啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)由同一順式作用元件調(diào)控的多個(gè)基因等。首先報(bào)道的應(yīng)用誘騙技術(shù)調(diào)控基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)是將E2FDecoy-ODNs轉(zhuǎn)導(dǎo)入球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈，結(jié)果顯著抑制了球囊損傷后2周內(nèi)的新生內(nèi)膜形成。隨后有人利用NF-κB Decoy-ODNs也顯著減輕了球囊損傷后鼠頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜的生成。近年來(lái)國(guó)內(nèi)有研究證明證實(shí)了轉(zhuǎn)染Egr-1Decoy-ODNs能夠有效抑制球囊損傷后大鼠頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜的過(guò)度增殖，其作用機(jī)制可能為抑制堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）或改善內(nèi)皮功能。

近年來(lái)研究表明，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移受多種因子（生長(zhǎng)因子和炎性因子等）、多條途徑調(diào)控，且呈網(wǎng)絡(luò)狀分布，而細(xì)胞周期可能是調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖的最終交匯點(diǎn)。G1→S期調(diào)控點(diǎn)（即G1／S限制點(diǎn)）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期調(diào)控中的兩個(gè)主要調(diào)控點(diǎn)之一，控制著細(xì)胞從G1進(jìn)入S期，決定了細(xì)胞對(duì)外界增殖信號(hào)的反應(yīng)（進(jìn)入有絲分裂，發(fā)生凋亡或進(jìn)入靜止期修復(fù)損傷DNA）。細(xì)胞周期的進(jìn)展依賴于細(xì)胞周期素（Cyclin）、細(xì)胞周期依賴性激酶（Cyclin-dependent kinase，CDK）以及細(xì)胞周期依賴性激酶抑制蛋白（CDK inhibitors，CKIs）的相互作用。CyclinD1作為G1期調(diào)控蛋白與CDK4形成的復(fù)合物在G1→S期轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用。另一項(xiàng)研究報(bào)告，轉(zhuǎn)染針對(duì)CDK2的反義寡核苷酸至球囊損傷的動(dòng)脈可以抑制內(nèi)膜增厚。最近的一項(xiàng)研究證實(shí)，應(yīng)用藥物干預(yù)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，可以抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，從而阻止內(nèi)膜增生。因此，抑制血管平滑肌細(xì)胞周期的進(jìn)程一直被視為一個(gè)控制血管平滑肌細(xì)胞增殖的有效策略。

PCNA基因?qū)儆谂c細(xì)胞增殖周期相關(guān)基因，在細(xì)胞的增殖啟動(dòng)過(guò)程中起重要作用。PCNA主要在細(xì)胞核表達(dá)，它作為DNA合成酶δ的輔基，為細(xì)胞增殖所必需，細(xì)胞分裂時(shí)協(xié)助DNA引導(dǎo)鏈和隨從鏈的合成；PCNA可以與CDK和Cyclin結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞增殖；它是DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂過(guò)程中DNA多聚酶最重要的輔助因子。在G1后期開(kāi)始表達(dá)，S期達(dá)高峰，G2和M期開(kāi)始下降，靜止期細(xì)胞表達(dá)很少，其量的變化與DNA合成一致，因此可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增生的一個(gè)指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明，正常的血管壁Egr-1、PCNA和CDK4微量表達(dá)，球囊損傷后，Egr-1、PCNA和CDK4表達(dá)上調(diào)，經(jīng)Decoy-ODNs治療后，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較SCR組和對(duì)照組明顯減輕。表明Decoy-ODN是一種新型的RNA水平上的強(qiáng)效基因滅活因子，通過(guò)抑制Egr-1的表達(dá)，在某種程度上也抑制了PCNA和CDK4的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，來(lái)抑制動(dòng)脈損傷后內(nèi)膜的增生。

本實(shí)驗(yàn)成功地從轉(zhuǎn)錄水平抑制了VSMC的增殖和內(nèi)膜增生，為臨床治療再狹窄提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究雖然證明可以減輕血管損傷后內(nèi)膜增生程度，但未能完全抑制內(nèi)膜增生，考慮有其他因素參與血管損傷后內(nèi)膜增生，這有待于進(jìn)一步研究。

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