肺癌患者RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)*

賈要麗，吳擁軍，吳秋歌，張 佳，馬東波，吳逸明，王 靜#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室 鄭州 450001

許多國(guó)家肺癌的發(fā)病率及病死率呈上升趨勢(shì)，目前肺癌已成為腫瘤死亡的首要原因。在中國(guó)，肺癌的發(fā)病率居各類(lèi)惡性腫瘤之首[1-2]；Ⅰ期肺癌的5 a生存率為60%，但是Ⅱ～Ⅳ期的5 a生存率最多至40%，最低還不到5%[3]。因此，提高肺癌的生存率依賴(lài)于肺癌的早期診斷，篩選和挖掘有價(jià)值的早期肺癌的生物學(xué)標(biāo)志物成為亟待解決的問(wèn)題。腫瘤細(xì)胞可以釋放DNA，使外周血清中含有豐富的DNA[4]，在肺癌患者的血液、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液中均可發(fā)現(xiàn)易感基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生了高甲基化[5]。作者通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異PCR(real-time methylation specific PCR，qMSP)[6]檢測(cè)肺癌患者和健康對(duì)照者外周血RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況，以期為肺癌的早期診斷提供幫助。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇2011年4月至2012年4月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科、胸外科住院的肺癌患者200例。男143例，女57例；年齡26～83(59.6±10.6)歲；組織學(xué)類(lèi)型：鱗癌87例，腺癌72例，小細(xì)胞肺癌33例，大細(xì)胞肺癌8例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期55例，Ⅲ、Ⅳ期145例；吸煙者107例，不吸煙者93例；所有患者均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，并且排除了其他多種腫瘤的可能。200例正常對(duì)照取自同期鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢科體檢正常的人群。男151例，女49例；年齡26～96(53.7±13.4)歲；吸煙者79例，不吸煙者121例；所有正常對(duì)照均未發(fā)現(xiàn)肺部或者其他器官的惡性腫瘤。抽取2組受試者晨起空腹肘靜脈血5 mL，置于-80 ℃保存。

1.2DNA提取和引物設(shè)計(jì)常規(guī)提取外周血基因組DNA，操作步驟嚴(yán)格按照上海萊楓公司全血基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA的濃度和純度，DNA溶液放于-20 ℃冰箱保存待用。RASSF1A和 FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)的引物序列[7-8]見(jiàn)表1。引物由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成。

1. 3DNA甲基化的qMSP檢測(cè)

1.3.1 DNA亞硫酸氫鹽處理 基因組DNA的甲基化修飾應(yīng)用Intergen CpGenome DNA修飾試劑盒(Qiagen公司)，1 μg 的DNA通過(guò) NaOH變性，再通過(guò)亞硫酸氫鈉修飾，50 ℃避光水浴過(guò)夜，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的胞嘧啶保持不變，修飾后的DNA通過(guò)乙醇沉淀回收并重懸于去離子水中，用于PCR。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 甲基化和非甲基化RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增的 PCR反應(yīng)體系：2×SYBY qPCR Master Mix(美國(guó)Promega公司)10 μL，上下游引物各0.5 μL，亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板5 μL，補(bǔ)水至20 μL；甲基化和非甲基化FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增的 PCR反應(yīng)體系：2×SYBY qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板4 μL，補(bǔ)水至20 μL。以經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理后的胎盤(pán)DNA作為未甲基化的陰性對(duì)照；以經(jīng)過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶處理后，再經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理的胎盤(pán)DNA作為甲基化的陽(yáng)性對(duì)照。PCR擴(kuò)增完成后，通過(guò)熔解曲線計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，每一個(gè)熒光定量PCR循環(huán)后會(huì)得到一個(gè)Ct值，樣本甲基化水平用甲基化率表示：甲基化率=1/(1+2)-ΔCt×100%(ΔCt=Ct非甲基化-Ct甲基化)[9]。每個(gè)樣本均做2個(gè)平行樣，每次甲基化分析過(guò)程中均有2個(gè)空白對(duì)照。

表1 引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)，連續(xù)性變量因數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布所以采用中位數(shù)(M)和上、下四分位數(shù)(P25、P75)描述。2組外周血RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率，不同臨床病理特征的肺癌患者外周血RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與肺癌危險(xiǎn)性的評(píng)估采用logistic回歸分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組外周血RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率比較見(jiàn)表2。

2.2不同臨床病理特征的肺癌患者外周血RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子甲基化率見(jiàn)表3。

表2 2組外周血RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率的比較 %

表3 不同臨床病理特征的肺癌患者外周血RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率 %

2.3RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與肺癌危險(xiǎn)性的關(guān)系隨著RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率增加，患肺癌的危險(xiǎn)性增加(表4)。

表4 RASSF1A和FHIT基因甲基化水平與肺癌危險(xiǎn)性的logistic回歸分析

經(jīng)過(guò)性別、年齡和吸煙水平的調(diào)整。

3 討論

啟動(dòng)子區(qū)域 CpG島基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化出現(xiàn)在許多惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制中。外周血中DNA甲基化水平的變化已被證明與包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤有關(guān)[10-12]。研究[10]發(fā)現(xiàn)重度吸煙者非肺癌患者中度和重度不典型增生組織中也發(fā)現(xiàn)存在FHIT基因的甲基化，提示FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化存在肺癌發(fā)生的早期。

該研究結(jié)果表明肺癌組的RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率高于正常對(duì)照組，提示RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能和肺癌的發(fā)生相關(guān)，這和之前的研究[10]一致；該研究結(jié)果表明性別、年齡、吸煙史、肺癌的組織學(xué)類(lèi)型及臨床分期對(duì)RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平?jīng)]有影響，與之前的報(bào)道[13]一致；也有些研究[14-15]表明年齡、吸煙和組織學(xué)類(lèi)型與RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化改變密切相關(guān)，因此，還需要擴(kuò)大樣本進(jìn)一步探討。該研究結(jié)果同時(shí)顯示RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平與肺癌的危險(xiǎn)性相關(guān)，隨著基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的增加，患肺癌的危險(xiǎn)性增加，表明RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化是肺癌的危險(xiǎn)因素，檢測(cè)患者外周血RASSF1A和FHIT基因的甲基化水平可能有助于肺癌的危險(xiǎn)性預(yù)測(cè)。

綜上所述，RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化和肺癌的早期診斷相關(guān)，采用qMSP檢測(cè)外周血中RASSF1A和FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平可能有助于肺癌的早期預(yù)警。

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