卵巢上皮性癌組織中SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化與β-catenin蛋白表達檢測

賈冬麗，李紅雨，秦巧紅

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

卵巢上皮性癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，約70%的患者就診時已屬晚期，其病死率高居婦科惡性腫瘤之首，晚期術(shù)后5 a生存率<30%，嚴(yán)重威脅廣大女性的生命健康，因此研究卵巢上皮性癌的發(fā)生及發(fā)展機制，阻斷其發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)，尋找新的治療靶點至關(guān)重要。分泌型卷曲相關(guān)蛋白5(secreted frizzled-related protein 5，SFRP5)基因作為一種抑癌基因，是Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的拮抗基因。目前已有乳癌、宮頸癌、結(jié)腸癌以及胃癌中SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化導(dǎo)致該基因沉默的報道[1-4]。作者檢測了卵巢上皮性癌組織中SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)和β-catenin蛋白的表達，并分析二者之間的關(guān)系，探討二者在卵巢上皮性癌發(fā)生發(fā)展中的可能機制，以期從分子水平揭示卵巢上皮性癌發(fā)生的原因。

1 材料與方法

1.1材料來源40例卵巢上皮性癌組織(21例卵巢漿液性囊腺癌、12例卵巢黏液性囊腺癌、7例子宮內(nèi)膜樣癌)，20例卵巢交界性上皮性腫瘤組織，20例正常卵巢上皮組織均來源于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科2009年6月至2012年3月的手術(shù)患者，患者年齡20～75歲。標(biāo)本均為石蠟包埋組織，均經(jīng)病理醫(yī)師復(fù)核?；颊咝g(shù)前均未接受放療、化療以及免疫治療。

1.2主要試劑兔抗人β-catenin單克隆抗體(使用時按50倍稀釋)，免疫組織化學(xué)SP試劑盒(SP-9000)和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；甲基化特異性PCR試劑盒(包括PCR試劑盒和亞硫酸氫鹽試劑盒)由北京天恩澤基因科技有限公司提供；甲基化引物和非甲基化引物由北京博大泰克生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，序列見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

M：甲基化引物； U：非甲基化引物。

1.3不同組織中SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測石蠟組織8 μm厚連續(xù)切片，取10～15片裝入1.5 mL離心管中，采用氯仿法提取組織DNA，然后嚴(yán)格按照甲基化特異性PCR試劑盒操作步驟進行DNA的亞硫酸氫鹽修飾，以修飾過的DNA作為模板進行PCR擴增。配制PCR反應(yīng)液，包括：修飾后的樣本DNA 2 μL，10×PCR緩沖液Ⅱ 5 μL，dNTPs 4 μL，DNA聚合酶1 μL，甲基化或非甲基化上、下游引物各1 μL，去離子水加至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃ 30 s，退火(甲基化引物退火溫度為61.8 ℃，非甲基化引物為52.7 ℃)30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。80例標(biāo)本隨機抽取10%進行重復(fù)實驗。每例樣本用甲基化引物和非甲基化引物分別進行擴增，若甲基化引物擴增出特異性條帶，而非甲基化引物未擴增出特異性條帶為完全甲基化；若只有非甲基化引物擴增出了特異性條帶為非甲基化；若甲基化引物和非甲基化引物均擴增出了特異性條帶為部分甲基化。

1.4不同組織中β-catenin蛋白的檢測應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法。3 μm厚石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化，微波抗原修復(fù)，依次加入體積分?jǐn)?shù)3%甲醇過氧化氫、羊血清封閉，再依次加入一抗、二抗，各孵育40 min后，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇中和，脫水透明，中性樹膠封片。以已知β-catenin陽性的癌組織切片作陽性對照，以PBS液代替一抗作空白對照。結(jié)果判定[5]：正常卵巢上皮組織中β-catenin蛋白主要表達于胞膜上，為棕黃色顆粒狀。光學(xué)顯微鏡下選取5個視野(×400)，每個視野計數(shù)100個細胞。按陽性細胞百分比和染色強度分別評分：陽性細胞百分比<25%為0分，25%～為1分，50%～為2分，75%～為3分；無染色0分，淡黃染色1分，深黃染色2分，棕黃染色3分。取兩種評分之和：0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為陽性，≥5分為強陽性；另外，>10%胞質(zhì)和(或)胞核出現(xiàn)β-catenin表達為異位表達。陽性、強陽性為正常表達，陰性、弱陽性和異位表達皆為異常表達。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行分析，分別

應(yīng)用確切概率法和χ2檢驗比較3種組織中SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化率和β-catenin異常表達率，應(yīng)用Pearson列聯(lián)系數(shù)分析卵巢上皮性癌組織中二者的關(guān)聯(lián)性，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3種組織中SFRP5基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)80例組織標(biāo)本均成功進行了甲基化特異性PCR檢測，進入了結(jié)果分析，見圖1、表2。

2.2 3種組織中β-catenin蛋白的表達見圖2、表2。

圖1 SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化特異性PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 3種組織中β-catenin蛋白的表達(SP，×400)

表2 3種組織中SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化率和β-catenin蛋白異常表達率比較 例(%)

*確切概率；△組間兩兩比較，P<0.017。

2.3卵巢上皮性癌組織中SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化與β-catenin蛋白異常表達的關(guān)聯(lián)性見表3。

表3 卵巢上皮性癌組織中SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化與β-catenin蛋白異常表達的關(guān)聯(lián)性 例

rP=0.468,P<0.001。

3 討論

近年來諸多研究已證實表觀遺傳學(xué)機制與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中DNA甲基化是重要的表觀遺傳學(xué)機制之一[6]。許多惡性腫瘤中抑癌基因啟動子區(qū)的CpG島發(fā)生甲基化，從而調(diào)控抑癌基因的表達，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。

SFRP5是SFRP家族中的一員，該家族包括5個成員：SFRP1～5，定位于染色體8p12-11.1。Qi等[3]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率為52.8%，發(fā)生甲基化的結(jié)腸癌細胞株經(jīng)去甲基化處理后SFRP5重新恢復(fù)表達；Ho等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢透明細胞癌組織和細胞株中均發(fā)現(xiàn)SFRP5超甲基化。該研究結(jié)果顯示，SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化率在卵巢上皮性癌組織中高于卵巢交界性上皮性腫瘤組織及正常卵巢上皮組織，提示SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)可能導(dǎo)致SFRP5基因抑癌功能的減弱或喪失，進而促進卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展。

β-catenin蛋白定位于染色體3p21.3-p22，是一種多功能胞質(zhì)蛋白和細胞骨架蛋白，是Wnt信號傳導(dǎo)通路的核心元件，其介導(dǎo)的Wnt信號傳導(dǎo)通路的異常激活與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[9-10]。該研究結(jié)果顯示β-catenin主要定位于胞膜，可異位表達于胞質(zhì)和胞核，與文獻[5]報道相符。該研究結(jié)果顯示β-catenin蛋白在卵巢上皮性癌組織中的異常表達率高于卵巢交界性上皮性腫瘤組織及正常卵巢上皮組織，提示β-catenin在卵巢上皮性癌組織中異常表達，可能因此激活Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路，該機制可能在卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

此外，該研究結(jié)果還顯示，在卵巢上皮性癌組織中SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化與β-catenin異常表達有關(guān)聯(lián)，提示SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)可能是引起β-catenin蛋白異常表達的機制之一。

總之，卵巢上皮性癌的發(fā)病機制十分復(fù)雜，SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)可能引起β-catenin在胞質(zhì)或胞核異常積聚，并有可能因此激活Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路；這可能為卵巢上皮性癌的預(yù)防和治療提供了新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點。

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