河南漢族肺結(jié)核患者PTPN22基因多態(tài)性檢測

肖 海，楊洪毅，張照婧，張言鵬，李曉文#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 4500523)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450052

蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22，PTPN22)基因編碼淋巴細胞特異性的蛋白酪氨酸磷酸酶(lymphoid tyrosine phosphatase, LYP)，在T細胞活化的信號傳導(dǎo)中起著重要的負調(diào)節(jié)作用[1]。作者應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測PTPN22基因rs33996649和rs2488457位點的多態(tài)性進，探討二者與河南漢族人群肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，TB)形成之間的關(guān)系，以期為TB的發(fā)病機制及治療診斷提供數(shù)據(jù)和參考。

1 對象與方法

1.1研究對象病例組：214例初診TB患者來自2010年至2012年河南安陽、新鄉(xiāng)、新密等地傳染病醫(yī)院的住院患者，其中男128例，女86例，年齡20～56(38.9±17.6)歲，TB的診斷符合中華人民共和國衛(wèi)生部通告[2008]2號文件的WS 288-2008 肺結(jié)核診斷標準，排除糖尿病、HIV感染、使用腎上腺皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑者。正常對照205例，其中男141例，女性64例，年齡20～52(36.0±15.7)歲，為同期體檢的健康個體。以上研究對象之間無血緣關(guān)系，并均得到本人或監(jiān)護人知情同意。

1.2PTPN22基因rs33996649與rs2488457位點的多態(tài)性檢測采用PCR-RFLP法。抽取研究對象的靜脈血3 mL，EDTA抗凝，酚/氯仿法提取基因組DNA。引物序列均來源于GeneBank，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。PCR反應(yīng)體系：樣本DNA 2 μL，Mix(含染料)10 μL，上、下游引物各1 μL，補充去離子水至20 μL。擴增條件：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 25 s，72℃ 30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。取PCR擴增產(chǎn)物10 μL，加相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶5 U，10×緩沖液2 μL，加去離子水補充體系到20 μL。rs33996649用MspⅠ消化，37 ℃水浴2 h，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳40 min；rs2488457用SacⅠ消化，37 ℃水浴3 h，35 g/L瓊脂糖凝膠電泳60 min。凝膠成像分析儀上觀察并分析結(jié)果，照相保存。

表1 rs33996649和rs2488457擴增引物及片段大小

1.3基因型判讀rs33996649位點擴增片段大小234 bp，經(jīng)MspⅠ消化后有3種基因型：C/C(143，91 bp)，G/G(234 bp)，G/C(234，143，91 bp)。rs2488457位點擴增片段大小為203 bp，經(jīng)內(nèi)切酶SacⅠ消化后基因型：C/C(181，22 bp)，G/G(203 bp)，G/C(203，181，22 bp)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。對2組PTPN22基因兩位點的基因型分布行Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用χ2檢驗比較2組間基因型頻率和等位基因頻率的差異，并計算比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)[2]。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

205 例正常人 和214例TB患者中rs33996649位點全部為C/C基因型，電泳結(jié)果見圖1。隨機抽取3例樣本進行測序，結(jié)果與電泳結(jié)果一致。

圖1 rs33996649PCR-RT-LP產(chǎn)物電泳圖

rs2488457位點檢測到2種基因和3種基因型(圖2)，對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=3.501，P=0.061)。病例組和對照組等位基因頻率及基因型頻率分布組間見表2。

圖2 rs2488457 PCR-RFLP 產(chǎn)物電泳圖

1～4、7～10、14：G/C基因型；5、11～13：C/C基因型；6：G/G基因型;M:Marker。

表2 2組rs2488457位點基因型頻率和基因頻率的比較 例(%)

3 討論

TB是由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染性疾病，是單一病原體致死人數(shù)最多的疾病，給人類的生命和健康構(gòu)成了極大的威脅[3]，其發(fā)病是復(fù)雜的多因素綜合作用的結(jié)果，影響因素不僅包括感染結(jié)核桿菌、環(huán)境因素，還涉及宿主的遺傳易感性。基因多態(tài)性位點可引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能上的改變，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染者的不同轉(zhuǎn)歸，即不同個體對TB表現(xiàn)出不同的易感性。

PTPs是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要調(diào)節(jié)因子,參與多種細胞功能的調(diào)控[4]。PTPN22定位于1p13.2，編碼的LYP 通過C端富含脯氨酸的基序與蛋白酪氨酸激酶連接從而抑制T細胞活化[5]。一旦PTPN22基因發(fā)生變異，LYP的功能或表達量會發(fā)生改變，從而引起T細胞信號引導(dǎo)障礙，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[6]。

rs2488457位于PTPN22啟動子序列，該位點變異直接影響LYP的編碼。Taniyama等[7]稱在日本人群、朝鮮族人群和高加索人群中rs2488457位點的多態(tài)性和Ⅰ型糖尿病易感性有關(guān)。Huang等[8]對廣東人群的研究發(fā)現(xiàn),rs2488457位點多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性有關(guān)。該研究顯示河南漢族人群中TB患者中rs2488457的G/G基因型頻率高于正常人，提示rs2488457的G/G基因型與河南漢族人群TB的發(fā)生有一定的關(guān)系。

rs33996649 位于第10外顯子LYP 的催化結(jié)構(gòu)域，該位點變異促使編碼的多肽鏈的263位氨基酸殘基由精氨酸轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺。 在單細胞水平上，Q263 對 TCR 信號通路蛋白去磷酸化的作用效率比野生型 R263 低，表明 Q263 是一種喪失功能型的變異，而且 LYP 的這種催化效率降低主要是由于催化結(jié)構(gòu)域的改變導(dǎo)致[9]。Lamsyah等[10]研究發(fā)現(xiàn)rs33996649與摩洛哥人群的TB易感性有關(guān)，并且有報告[11]稱該位點與北美人群、西班牙人群、挪威人群的自身免疫性疾病有關(guān)，但Huang等[8]發(fā)現(xiàn)該位點在廣東人群中沒有多態(tài)性，作者在河南漢族人群中也未發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性，表明其多態(tài)性存在種族差異。PTPN22基因編碼的LYP蛋白在免疫細胞中的重要調(diào)節(jié)作用，因此有必要在中國人群中進一步尋找新的單核苷酸多態(tài)性位點并探討其與TB的相關(guān)性。

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