RP－HPLC測(cè)定馬齒莧黃酮提取物中染料木苷的含量

雷紅偉 徐麗君 董 慧 鄒 欣 陸付耳△

1 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，武漢 430030

2 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，武漢 430065

馬齒莧（Portul acaoler aceaL.）系馬齒莧科馬齒莧屬一年生草本植物，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》?，F(xiàn)代藥理研究［1］證明馬齒莧具有抗菌、降血脂、抗衰老、抗炎、鎮(zhèn)痛、降糖以及促進(jìn)傷口愈合等作用。本所前期研究［2］發(fā)現(xiàn)馬齒莧改善2型糖尿病（T2DM）的脂質(zhì)代謝，進(jìn)一步的研究［3－4］發(fā)現(xiàn)馬齒莧黃酮有效部位可改善T2DM大鼠糖耐量異常。有資料［5］表明馬齒莧含有許多黃酮類(lèi)的物質(zhì)，為進(jìn)一步明確馬齒莧黃酮有效部位改善胰島素抵抗的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)首次使用HPLC分析了馬齒莧黃酮的相關(guān)成分，檢測(cè)到其含有染料木苷并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器

美國(guó)Waters公司高效液相色譜儀（Waters600 Controller，Waters 2487 Dual Absorbance Detector，Waters717 Plus Antosampler，Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)），色譜柱：Sunfire C18 column（250.0 mm×4.0 mm，5.0μm）（美國(guó)），VF型純水裝置（美國(guó)），BUCHI R－200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士），WF－700型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（日本），BT25－型1／10萬(wàn)電子天平（中國(guó)）。

1.2 試劑

染料木苷對(duì)照品（批號(hào)：200501）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，甲醇（HPLC純，批號(hào)：20080610）購(gòu)自天津巿科密歐化學(xué)試劑有限公司，冰醋酸（批號(hào)：20080308）購(gòu)自天津巿東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠，無(wú)水乙醇（批號(hào)：20071015）購(gòu)自天津巿廣成化學(xué)試劑有限公司，馬齒莧（同濟(jì)醫(yī)院中藥房提供）由湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室吳和珍副教授鑒定為Portul acaoler aceaL.，馬齒莧黃酮部位由本所分離、純化。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件

Sunfire C18 colu mn（250.0 mm×4.0 mm，5.0 μm）色譜柱（美國(guó)）；流動(dòng)相：甲醇∶冰醋酸∶水＝45∶1∶55；流速：0.8 ml／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：259 n m；柱溫：25℃。在該色譜條件下，樣品中被測(cè)成分能夠達(dá)到基線分離，染料木苷保留時(shí)間為8.9 min。見(jiàn)圖1。

圖1 樣品及對(duì)照品HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取染料木苷對(duì)照品1 mg溶于100 ml容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度線，超聲助溶5 min，成10 mg／L染料木苷標(biāo)準(zhǔn)母液。再精密吸取10 mg／L染料木苷標(biāo)準(zhǔn)母液2.5 ml于100 ml容量瓶中，50%甲醇定容至刻度線，配成250μg／L染料木苷標(biāo)準(zhǔn)液。

2.3 樣品溶液的制備

取馬齒莧黃酮提取液（含生藥6 kg／L）10 ml于100 ml容量瓶中，50%甲醇定容至刻度線，超聲助溶5 min，得含生藥0.6 kg／L馬齒莧黃酮提取物溶液，再取1 ml含生藥0.6 kg／L馬齒莧黃酮提取物溶液于10 ml容量瓶中，50%甲醇定容至刻度線，超聲助溶5min，得含生藥60 g／L的供試樣品溶液，0.45μm濾膜過(guò)濾備用。

2.4 線性關(guān)系考察

分別吸取8.00、4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 ml上述250μg／L染料木苷標(biāo)準(zhǔn)液于10 ml容量瓶中，以50%甲醇定容至刻度線，依次得濃度為200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25μg／L的標(biāo)準(zhǔn)液，分別以10μl進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品在0.062 5～2.000 0 ng范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，回歸方程為Y＝7 952.3X－87.876。見(jiàn)圖2。

圖2 染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量與峰面積的回歸關(guān)系圖

2.5 精密度考察

取100μg／L對(duì)照品溶液6份，分別以10μl進(jìn)樣，計(jì)算峰面積積分值RSD＝0.56%。

2.6 重現(xiàn)性考察

取6份供試品溶液，分別以10μl進(jìn)樣，計(jì)算峰面積積分值RSD＝0.93%。

2.7 穩(wěn)定性考察

取同批供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h，按含量測(cè)定方法，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，6次測(cè)得峰面積積分值RSD＝0.95%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的供試品5份，每份3 ml，分別加入含一定量染料木苷的對(duì)照品1 ml，超聲助溶5 min，0.45μm濾膜過(guò)濾備用。按上述色譜條件測(cè)定，其平均回收率為98.30%，RSD＝0.57%。見(jiàn)表1。

2.9 樣品測(cè)定

精密吸取含生藥60 g／L的供試樣品溶液3份，每份1 ml。以對(duì)照品溶液和樣品溶液分別進(jìn)樣，照上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明樣品峰均面積為1 230，外標(biāo)法計(jì)算顯示含生藥60 g／L馬齒莧黃酮樣品液含染料木苷的平均濃度為16.6μg／L，含生藥6 kg／L馬齒莧黃酮提取液中平均含染料木苷1.66 mg／L。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

馬齒莧隸屬馬齒莧科，是一年生草本植物，民間稱為長(zhǎng)壽菜。馬齒莧味酸、性寒，具有清熱解毒、涼血止血、散血消腫等作用，主治熱痢膿血、帶下、熱淋、癰腫惡瘡、丹毒等［6］。任潔等［7］的現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)馬齒莧具有抗糖尿病的作用。本所前期大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，馬齒莧及其不同部位均能改善動(dòng)物體內(nèi)的糖、脂代謝，特別是馬齒莧黃酮部位。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)［8］也證明馬齒莧及其不同部位均能改善體外細(xì)胞的脂質(zhì)代謝紊亂。馬齒莧黃酮的藥理學(xué)研究目前已逐漸增多，其改善胰島素抵抗綜合征的作用倍受注目。Awad［5］報(bào)道馬齒莧中含有染料木素、染料木苷等異黃酮類(lèi)的物質(zhì)。染料木素、染料木苷等作為大豆異黃酮類(lèi)物質(zhì)在抗癌作用方面的研究國(guó)內(nèi)外已有大量報(bào)道，近期其抗糖尿病方面的作用也引起人們的注意［9］，本所近期研究［10］也證明染料木素可改善胰島素抵抗。為明確馬齒莧黃酮改善胰島素抵抗的作用與染料木素、染料木苷等物質(zhì)間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)［11］用RP－HPLC測(cè)定了馬齒莧黃酮提取液中的染料木素。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以甲醇∶冰醋酸∶水（45∶1∶55）為流動(dòng)相的樣品HPLC圖中有一峰與染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致，均為8.9 min，如圖1，且被測(cè)峰與其他峰達(dá)基線分離，因此判定馬齒莧黃酮提取物中含有染料木苷。染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品在0.062 5～2.000 0 ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，r＝0.999 9，如圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，精密度實(shí)驗(yàn)RSD＝0.56%；重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)RSD＝0.93%；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD＝0.95%；加樣回收實(shí)驗(yàn)RSD＝0.57%，實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠，可用于測(cè)定馬齒莧黃酮提取物中染料木苷的含量。結(jié)果顯示，含生藥6 kg／L馬齒莧黃酮提取液中含染料木苷，染料木素含量為1.66 mg／L。本次實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究馬齒莧黃酮有效部位改善胰島素抵抗的作用機(jī)制提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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