B抗原減弱表型的表型頻率與ABO基因分析

池 泉，張 愛，任本春

(福建省血液中心，福建福州350004)

ABO亞型通常根據(jù)其血清學特征進行分類，A 亞型可分為A2、A3、Aend、Ax、Am、Ay、Ael等，B 亞型的分類通常參照A亞型，但沒有B2［1］。然而在日常ABO血型鑒定過程中，經(jīng)?？捎龅紹抗原表達減弱(凝集強度中等)的樣本，有些還可產(chǎn)生不規(guī)則抗-B，其血清學表現(xiàn)不符合B3、Bx、Bm和Bel等亞型的分類標準，在國內(nèi)曾一度被認為應(yīng)判定為B2亞型［2］。ABO基因變異導致糖基轉(zhuǎn)移酶活性改變，是紅細胞上A或B抗原表達異常的最常見原因。但以往對此類B抗原減弱表型多以血清學分析報道為主，未進行進一步的ABO基因分析。為更好地了解B抗原減弱表型的分子遺傳學基礎(chǔ)，我們在日常血型鑒定過程中收集了部分具有該特征的B型或AB型個體血液樣本，對其血清學和ABO基因進行了初步分析。

材料和方法

一、研究對象

從2007年至2010年間在福建省血液中心獻血的獻血者241 952例中篩查出的B抗原減弱的獻血者及部分家系成員。所有樣本均為乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血。

二、血型血清學鑒定

采用單克隆抗-A、抗-B(上海血液生物制品公司產(chǎn)品)和A、B、O型紅細胞(實驗室自制)，對所有獻血者進行ABO血型鑒定(正反定型，微孔板法);采用單克隆抗-A、抗-B、抗-H(上海血液生物制品公司產(chǎn)品)和人源抗-A、抗-B血清及A、B、O型紅細胞(實驗室自制)，用試管法凝集試驗對篩查出的B抗原減弱個體(微板法呈弱凝集)及家系成員血樣進行B抗原減弱表型的確認和血清學分析。

三、標本的DNA提取

使用基因組DNA純化試劑盒(Qiagen公司產(chǎn)品)按照試劑說明書抽提B抗原減弱個體及家系成員樣本的基因組DNA，用于ABO基因的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增與測序分析。

四、ABO基因第6、7外顯子及第6內(nèi)含子PCR擴增

以人類ABO基因(GenBank Accession Number NC_000009)為模板，應(yīng)用 Primer3 Input軟件(V0.4.0)(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)在線設(shè)計引物(F1:5'-GTGGTCAGAGGAGGCAGAAG-3'，R1:5'-TGTGTGTGATTTGAGGTGGG-3')用于擴增第6、7外顯子及第6內(nèi)含子共2 145 bp片段。PCR反應(yīng)體系包括:dNTP 400μmol/L，Mg2+2.5 μmol/L，10×PCR 緩沖液5 μL，Taq 酶0.5 U，模板 DNA 500 ng，引物10 pmol/L，終反應(yīng)體系50μL;循環(huán)參數(shù):94℃熱啟動3 min，94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 130 s;30個循環(huán)后 72℃10 min。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

五、ABO基因第6、7外顯子及第6內(nèi)含子序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后直接測序，測序引物為F1、R1、F2(5'-AGAGGATGCTGGCAGAGCCGTGGTC-3')、R2(5'-GGTGCCGAACAGCGGAGTCAGGAT3')。用Chromas 2.01軟件閱讀測序圖譜，使用 DANMAN5.22軟件將測定序列與B101序列進行比對。

結(jié) 果

一、血清學檢查結(jié)果

從241 952名獻血者(扣除重復獻血者后，其中B型59 979名、AB型16 505名)中共檢出B抗原減弱13例(其中B型9例、AB型4例)。據(jù)此估計，B抗原減弱表型在福建省人群中的頻率約為1∶18 000，其中在B型人群中的頻率約為1∶7 000，在AB型人群中的頻率約為1∶4 000。檢出樣本的血清學檢查結(jié)果見表1。

表1 13例B抗原減弱樣本的血清學檢查與ABO基因分型結(jié)果

二、ABO基因分析

根據(jù)各樣本ABO基因第6、7外顯子及第6內(nèi)含子的序列比較結(jié)果，13例B抗原減弱樣本的ABO基因型分別為:A102/Bw121例，B101/B101 2例，B101/O01 4例，B101/O02和 A102/B101各3例(見表1)。除在13號樣本中檢出Bw12等位基因外，其余樣本的ABO基因均為常見等位基因。

三、家系調(diào)查

對1例基因型為B101/O01的獻血者(8號)進行了家系成員的血型檢測和分析，先證者父親檢出為具有相同的B抗原減弱表型，ABO基因型為B101/O01(見圖1)。

圖1 8號獻血者的家系調(diào)查結(jié)果

討 論

B亞型的血清學分類標準至今仍較不明確，其分類通常參照 A亞型，但沒有 B2亞型。Salmon［3］曾在1976年提出參照A亞型的標準簡單將 B 亞型分為B3、Bx、Bm、Bel，同時將不符合這4類亞型標準的其它弱表型歸為Bw。對于B亞型血清學分類的討論或共識較少，可能與高加索人群中B型以及B亞型的頻率較低且案例較少有關(guān)。血型及其亞型在不同的人群中有不同的分布特征，例如在高加索人群中A2亞型約占A型人的20%，而在漢族人群則僅為0.5%;與西方人群A亞型頻率高于B亞型的情況相反，東方人群的B亞型頻率要高于A亞型。日本的Yamaguchi等［4］在對700 000名獻血者的血型分析中，Bx和Bm的頻率要高于Ax和Am;向東等［5］報道的上海地區(qū)ABO亞型的分析中，B亞型的頻率也明顯高于A亞型。

雖然B亞型分類中并無B2亞型，但上世紀90年代，我國曾有不少針對B型中是否存在B2亞型的討論，并相繼有10例以上的血清學個例分析報道［2，5］。有學者認為在B亞型分類中納入與A2亞型相對應(yīng)的B2亞型符合中國人群的實際［6］。概括所謂B2亞型的血清學特征主要為:紅細胞與抗-B的凝集強度介于正常 B型與B3之間，與抗-H的凝集強度介于O細胞與B細胞之間，部分個體血清中可檢出不規(guī)則抗-B。本研究中各樣本紅細胞與抗-B的反應(yīng)強度均在2+左右，與抗-H的反應(yīng)強度均增強，有2例樣本檢出了不規(guī)則抗-B，血清學特征與以往報道的B2亞型相似。本研究的篩查顯示該表型在人群中具有一定的分布頻率，其他地區(qū)該表型的人群頻率、血清學特征，有待于更多研究者的進一步的識別、研究和分析。由于本研究B抗原減弱表型的篩查僅采用一個廠家生產(chǎn)的單克隆抗體試劑進行，若該類抗原減弱由部分抗原表位的缺失引起，采用來自不同克隆株的單克隆抗體試劑可能會得到不同的結(jié)果和發(fā)現(xiàn)。

ABO血型抗原的弱表達受多種因素的影響，其中以ABO基因酶催化活性區(qū)域的編碼序列錯義突變最為常見，是形成 ABO亞型的主要原因［1］。另外如ABO基因酶催化活性區(qū)域外的編碼序列錯義突變、糖基轉(zhuǎn)移酶分泌不足、前體物質(zhì)的變異或缺乏、其他轉(zhuǎn)移酶的合成干擾等，也可能引起ABO血型抗原的弱表達。ABO基因全長18 kb，包含7個外顯子，其中第6和7外顯子占全部編碼序列的77%。編碼91%的ABO糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性區(qū)域，目前已報道的大多ABO亞型相關(guān)等位基因的點突變發(fā)生在該區(qū)域［7］。本研究中1例樣本在第6外顯子檢出了278C＞T的突變(Bw12等位基因)，該突變導致B基因編碼產(chǎn)物的第93位氨基酸由脯氨酸(Pro)轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?Leu)。Bw12等位基因由許國先等［8］在1例 ABw亞型(與抗-B凝集強度為w)個體中首次發(fā)現(xiàn)并報道，為稀有等位基因。與之不同，本研究中的該例樣本B抗原中度減弱，與抗-B的凝集還強于本研究中的其他B抗原減弱樣本(見表1)。本研究從B抗原減弱個體中檢出該等位基因，再次表明278C＞T突變對酶產(chǎn)物的活性具有一定影響，同時也再次驗證ABO血型抗原的合成機制受多種因素影響，不同個體間即便含有相同的等位基因或突變也可能有著不同的血清學表現(xiàn)。本研究其余12例樣本的第6和7外顯子序列與常見等位基因相同，未發(fā)現(xiàn)存在突變，但其中1例的家系調(diào)查結(jié)果卻提示B抗原減弱表型存在遺傳的可能。已有研究表明［9-10］，部分ABO亞型的形成與ABO基因第1至5外顯子、啟動子區(qū)域和CBF/NF-Y增強子區(qū)域的突變有關(guān)，因此還需對ABO基因的其他序列進行檢測，以明確這些弱表達是由ABO基因的其他區(qū)域突變引起，還是受非ABO基因的因素影響。

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