酶抑制法測(cè)定m-AST試劑性能評(píng)價(jià)及其在肝病中的意義

李 君， 謝勁松， 臧桂珍

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京210003)

血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)有2種受不同基因控制的同工酶，分別為來自細(xì)胞質(zhì)中的同工酶(c-AST)和來自線粒體的同工酶(m-AST)。AST廣泛存在于人體各組織細(xì)胞中，尤以心、肝含量最高。c-AST升高表示細(xì)胞膜通透性改變，m-AST活性增高表示線粒體膜通透性增加或細(xì)胞壞死。因此m-AST檢測(cè)更能夠客觀地反映細(xì)胞的受損程度［1］。檢測(cè)m-AST活性的方法很多，酶抑制法是近年推出的測(cè)定m-AST的新方法。我們對(duì)酶抑制法測(cè)定m-AST的方法學(xué)進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，并檢測(cè)了正常人和不同肝病患者血清AST和m-AST。

材料和方法

一、研究對(duì)象

選取東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京第二醫(yī)院2011年11月至2012年3月住院的肝病患者259例，其中男149例，女110例，年齡18～75歲;根據(jù)2000年全國第10次病毒性肝炎與肝病學(xué)會(huì)議制定的診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)［2］確診，包括急性肝炎43例、慢性病毒性肝炎95例、肝衰竭20例、重型肝炎11例、肝硬化代償期40例、肝硬化失代償期9例、原發(fā)性肝癌41例。選擇同期在東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京第二醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的健康人220名作為正常對(duì)照組，男130例，女90例，年齡18～70歲，均無心、腦、肝、腎等系統(tǒng)疾病。

二、方法

采用酶抑制法測(cè)定m-AST活性，試劑中含有的蛋白酶可以完全抑制c-AST的活性，而m-AST活性不受影響，用速率法測(cè)定剩余AST活性既為m-AST活性。NADH在340 nm處有特異性吸收峰，而在AST催化過程中 NADH易被氧化成NAD+，且氧化速率與AST活性成正比，所以AST活力可以用340 nm處測(cè)得的NADH吸光度的下降速率表示。

三、標(biāo)本收集

清晨空腹采集外周血3.0 mL，分離血清，所有標(biāo)本均無溶血和脂血現(xiàn)象，在2 h內(nèi)完成檢測(cè)。

四、試劑與儀器

m-AST試劑盒及配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品由寧波普瑞柏生物技術(shù)有限公司提供，AST檢測(cè)試劑盒及配套校準(zhǔn)品由北京萊邦生物技術(shù)有限公司提供，按試劑盒說明書在HITACHI7600-120全自動(dòng)生化分析儀上編制好實(shí)驗(yàn)參數(shù)，用配套校準(zhǔn)品校準(zhǔn)，室內(nèi)質(zhì)控在控后測(cè)定標(biāo)本。

五、方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.精密度試驗(yàn) 收集低(25.3 U/L)、中(107.3 U/L)、高(213.0 U/L)3 個(gè)濃度的患者混合血清標(biāo)本，連續(xù)檢測(cè)20次，計(jì)算批內(nèi)精密度［變異系數(shù)(CV)］。再用上述標(biāo)本連續(xù)測(cè)定20 d，上、下午各測(cè)1次，計(jì)算批間精密度(CV)。

2.回收試驗(yàn) 準(zhǔn)備1份混合血清，分4份，每份1mL，在每份血清中分別加入濃度為113 U/L的 m-AST 標(biāo)準(zhǔn)品0、0.1、0.2、0.3 mL，再分別加入生理鹽水 0.3、0.2、0.1、0 mL，通過測(cè)定值減去各自原血清濃度確定回收量和回收率。

3.線性試驗(yàn) 取濃度為452 U/L(儀器自動(dòng)稀釋測(cè)得結(jié)果)的混合血清，用生理鹽水按1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1、原倍稀釋，結(jié)果分別為66.8、131.2、195.9、260.4、323.6、389.9、456.2 U/L。以理論值為Y、測(cè)定值為X計(jì)算回歸方程。

4.c-AST抑制試驗(yàn) 取新鮮肝臟標(biāo)本，用0.25 mol/L蔗糖溶液攪勻，高速離心，取上清，用二乙氨基乙基纖維素柱色譜法提純。初步提純的m-AST和c-AST再分別依次在磷酸鹽緩沖液(100 mol/L，pH 值 5.5)中層析 25 h，在Tris緩沖液(80 mol/L，pH 值 7.6)中層析 12h，聚乙二醇20000濃縮。純化的m-AST和c-AST分別用生理鹽水配制成3個(gè)不同的濃度，再用m-AST和AST試劑(不含抑制酶)分別檢測(cè)。

5.比對(duì)試驗(yàn) 將40份血清標(biāo)本(范圍為3.0～200.0 U/L)同時(shí)用酶抑制法(Y)和免疫抑制法(X)(試劑由上海玉蘭生物技術(shù)研究所生產(chǎn))在HITACHI7600-120全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)。

6.溶血干擾試驗(yàn) 在高、低2種m-AST濃度的混合血清中分別加入稀釋好的不同濃度的血紅蛋白(Hb)液，使 Hb 濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L，對(duì)照管中加入同體積蒸餾水，檢測(cè)m-AST濃度。

7.試劑穩(wěn)定性 將試劑置于室溫(25℃)，每1 h測(cè)1次試劑空白吸光度(A)值;將液體試劑置于4℃冰箱保存，每月測(cè)1次試劑空白A值。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Microsoft Excel2003和SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量結(jié)果用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精密度試驗(yàn)

低(25.3 U/L)、中(107.3 U/L)、高(213.0 U/L)3個(gè)濃度標(biāo)本的批內(nèi)CV分別為2.23%、0.59%、0.61%，批間 CV 分別為5.45%、5.24%、6.23%。

二、回收試驗(yàn)

3個(gè)濃度回收率均在90%～110%以內(nèi)，平均回收率為104.97%，屬可接受范圍。見表1。

表1 回收試驗(yàn)(%)

三、線性試驗(yàn)

以理論值為Y、測(cè)定值為X計(jì)算回歸方程為Y=0.997X－1.51，相關(guān)系數(shù)(r)=0.999 9。酶抑制法檢測(cè)m-AST在450 U/L范圍內(nèi)線性良好。

四、c-AST抑制試驗(yàn)

分別采用m-AST和AST試劑(不含抑制酶)檢測(cè) m-AST純品，檢測(cè)結(jié)果分別為12、60、304 U/L和 11、62、306 U/L，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.4);c-AST 純品的檢測(cè)結(jié)果分別為0.1、0.2、0.2 U/L和 92、378、1 504 U/L。說明酶抑制法 m-AST試劑可完全抑制1 500 U/L的c-AST活性，但不影響m-AST活性。

五、比對(duì)試驗(yàn)

同時(shí)采用酶抑制法(Y)和免疫抑制法測(cè)定40份血清樣品的回歸方程為Y=0.985 7X－0.250 4，r=0.999 8。

六、溶血干擾試驗(yàn)

當(dāng) Hb 濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L、m-AST 濃度為11.55 U/L 時(shí)，偏差分別為0.9%、8.6%、16.7%、42.5%、72.3%;當(dāng)m-AST濃度為44.55 U/L時(shí)，偏差分別為0.6%、4.7%、8.1%、11.3%、21.9%。

七、試劑穩(wěn)定性

將試劑置室溫(25℃)時(shí)，10 h之內(nèi)A值無明顯改變;將液體試劑置4℃冰箱保存，6個(gè)月之內(nèi)試劑空白A值基本不變。酶抑制法試劑的穩(wěn)定性能較好。

八、參考區(qū)間

根據(jù)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，男、女2組數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布。以95%可信區(qū)間(±1.96s)初步確定參考區(qū)間男性為3.1～9.5 U/L，女性為2.5～8.7 U/L，男、女性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，但均在試劑說明書提供的參考區(qū)間(≤10 U/L)內(nèi)。正常成年人年齡間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

九、不同類型肝病患者m-AST濃度變化

各肝病組m-AST活性均高于正常對(duì)照組(P＜0.05、P＜0.01);m-AST 活性的改變與AST變化呈正相關(guān)。隨著肝細(xì)胞損害程度的不同，m-AST活性升高程度依次為重型肝炎＞肝硬化失代償＞急性病毒性肝炎＞肝衰竭＞慢性病毒性肝炎＞原發(fā)性肝癌＞肝硬化，各肝病組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。m-AST/AST比值除肝硬化失代償組外，其余各肝病組均低于正常對(duì)照組(P＜0.05);各肝病組中除肝衰竭組 m-AST/AST比值低于其他各組(P＜0.05)外，其余各組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 對(duì)照組及不同肝病組入院時(shí)血清m-AST與AST活性測(cè)定結(jié)果

討 論

m-AST測(cè)定早期采用電泳法、離子交換柱層析法等，操作繁瑣，受多種因素影響，變異較大，靈敏度低，特異性差;酶免疫法自動(dòng)化程度低，均不適用于大批量操作。放射免疫法有污染、試劑保存期限短的缺點(diǎn)。近年來報(bào)道比較多的免疫抑制法雖特異、準(zhǔn)確，自動(dòng)化程度高，但此方法影響因素較多，尤其與抗體制備及比例有很大的關(guān)系，因此各單位測(cè)定值相差甚遠(yuǎn)，文獻(xiàn)報(bào)道其線性范圍通常在120～200 U/L以下［3-5］。本研究使用酶抑制法檢測(cè)m-AST活性，具有較高精密度和回收率，有良好的準(zhǔn)確度和較寬的線性范圍;適用于各種全自動(dòng)生化儀，因此更適宜臨床推廣和應(yīng)用。因紅細(xì)胞中m-AST含量較高，因此溶血對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大。

血清AST屬非特異性酶，其升高對(duì)診斷具體疾病無特異性，在診斷肝病方面也沒有ALT靈敏，但對(duì)肝細(xì)胞損傷程度的評(píng)估是有價(jià)值的指標(biāo)。m-AST 80%分布在線粒體內(nèi)，正常人血清中AST主要是c-AST，m-AST含量很低甚至無。當(dāng)肝細(xì)胞壞死、線粒體崩解時(shí)，附著在線粒體上的m-AST大量釋放血中，導(dǎo)致血清m-AST急劇升高。但m-AST在血清中易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，半衰期短，其清除率比c-AST快5倍以上，當(dāng)細(xì)胞不再受破壞時(shí)，血清m-AST很快下降，甚至回復(fù)正常水平，故m-AST可作預(yù)后指標(biāo)。

本研究各類肝病患者m-AST活性均高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，并且隨著病情變化，m-AST活性的改變與AST變化呈正相關(guān)。隨著肝細(xì)胞損害程度不同，m-AST升高程度為重型肝炎＞肝硬化失代償＞急性病毒性肝炎＞肝衰竭＞慢性病毒性肝炎＞原發(fā)性肝癌＞肝硬化，各肝病組之間m-AST差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示m-AST活性測(cè)定可作為判斷肝細(xì)胞損傷程度的可靠指標(biāo)，對(duì)肝臟疾病的臨床分類和預(yù)后具有一定價(jià)值。

220名正常人 m-AST/AST比值為0.30±0.07，這與國外文獻(xiàn)［6］報(bào)道的10%以下有很大不同，而國內(nèi)不同文獻(xiàn)報(bào)道差異很大［5，7-9］，主要原因可能與方法學(xué)不同有關(guān)，近年文獻(xiàn)報(bào)道均為免疫抑制法，此法影響因素較多。本研究結(jié)果還顯示除失代償期肝硬化患者外，其余各組患者的m-AST/AST比值低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，與毛小紅［8］的報(bào)道一致。肝衰竭患者m-AST/AST比值低于其他各組(P＜0.05)外，其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明m-AST/AST比值的變化不如m-AST活性變化明顯，原因?yàn)楦渭?xì)胞發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)m-AST大量釋放，但m-AST清除率比c-AST快，故血清中m-AST與總AST活性同步升高。因此m-AST絕對(duì)值臨床意義更重要。

本研究失代償期肝硬化患者m-AST與AST的相關(guān)系數(shù)僅為0.61。原因可能與患者病情加重、酶膽分離有關(guān)，但因病例數(shù)太少，尚需進(jìn)一步研究。

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