D-半乳糖誘發(fā)的衰老對大鼠下頜下腺p16/Rb細胞信號轉導通路的影響

葛志華 李俊玫 于海忠 楊 寧 楊佳寧 崔宙開 王春艷

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院科研處，河北 承德 067000)

衰老對細胞信號傳遞系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)在對細胞周期進程及與細胞生長增殖相關的轉錄調控因子功能的影響。與衰老有關的細胞周期調控信號因子及途徑多而復雜，且與細胞的類型和組織來源有關。其中p16/Rb信號通路、p53/Rb信號通路起著重要作用。下頜下腺是具有內、外雙重分泌功能的腺體，它在內環(huán)境自穩(wěn)機制中發(fā)揮其獨特的作用。關于衰老下頜下腺組織中Rb細胞轉導通路蛋白的表達國內外尚未見報道。本實驗觀察衰老大鼠下頜下腺組織磷酸化cyclinD1蛋白、p16、非磷酸化Rb蛋白的表達變化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 MK3酶標儀:芬蘭雷勃公司，PCR儀:美國MJResearch公司，DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀:德國Leica公司。磷酸化cyclinD1抗體:上海邁新生物科技有限公司;p16和非磷酸化Rb單克隆抗體:北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 實驗動物的選擇及分組 實驗大鼠購自河北省實驗動物中心，合格證編號:605106，選用8周齡清潔級SD雌性大鼠30只，體重180～220 g，隨機分為正常組和模型組，每組15只。

1.3 模型的建立及各組動物的處理方法 正常組大鼠正常喂60 d。模型組大鼠腹腔注射6%D-半乳糖(300 mg·kg－1·d－1)，連續(xù) 60 d。

1.4 取材、固定及免疫組織化學染色 大鼠經10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉后，開胸，經左心室插管入主動脈，生理鹽水沖凈血液后，用4%多聚甲醛進行灌注固定、取雙側下頜下腺，常規(guī)ABC免疫組織化學染色顯示磷酸化cyclinD1蛋白的表達。

1.5 Western印跡法檢測p16INK4a、非磷酸化Rb蛋白含量 提取下頜下腺細胞總蛋白，測定各實驗組總蛋白含量，分裝儲存;電泳分離蛋白質至溴酚藍移動至膠底部終止。將凝膠上的蛋白質轉移到PVDF膜上;封閉PVDF膜分別加入Rb、p16單克隆抗體(抗體稀釋度:1∶200)，室溫2 h;放入雜交盒，加入HRP標記相應二抗(抗體稀釋度:1∶2 000)，孵育1 h;將PVDF膜平鋪、顯色、曝光、顯影、定影。將條帶掃描至計算機中，用軟件Bandscan5.0進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。計量資料描述采用s，組間比較行單因素方差分析。

2 結果

2.1 下頜下腺磷酸化cyclinD1蛋白含量的改變 磷酸化cyclinD1蛋白在正常及實驗組大鼠下頜下腺的腺泡細胞、顆粒曲管及其他導管上皮細胞中均有表達，磷酸化cyclinD1陽性顆粒散在分布于細胞質內，呈黃色或棕黃色，見圖1，模型組磷酸化cyclinD1蛋白的表達比較正常組明顯降低(P＜0.01)。

圖1 各組下頜下腺cyclinD1蛋白表達(DAB，×400)

2.2 p16INK4a和非磷酸化Rb蛋白含量檢測結果 Rb表達以模型組明顯高于正常組(P＜0.01);p16表達模型組比較正常組明顯升高(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠下頜下腺cyclinD1、p16、Rb的表達( s，n=15)

表1 各組大鼠下頜下腺cyclinD1、p16、Rb的表達( s，n=15)

與模型組比較:1)P＜0.01

分組 cyclinD1 P16(OD)Rb(OD)正常組 54.78±4.841) 0.48±0.021) 0.81±0.031)模型組19.11±2.21 1.94±0.02 1.69±0.03

3 討論

細胞衰老是隨著時間的推移，細胞增殖能力和生理功能逐漸下降的變化過程。細胞衰老過程受控于細胞信號傳遞系統(tǒng)。衰老對細胞信號傳遞系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)在對細胞周期進程及與細胞生長增殖相關的轉錄調控因子功能的影響。研究發(fā)現(xiàn)p16INK4a-pRb和ARF-p53這兩條細胞調控通路與細胞衰老過程密切相關〔1〕，任何一條通路的阻滯，都能讓細胞的周期出現(xiàn)停滯。

細胞周期的進程受cyclin、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(CKI)等調控因子及相互作用的調節(jié)。cyclinD1是G1期蛋白，在G1期和G1/S期交界處發(fā)揮作用，與CDK4/CDK6形成復合體催化Rb蛋白磷酸化。Rb蛋白對細胞周期中最關鍵的調控點G1/S期、G2/M期起著“閘門”的作用，Rb蛋白磷酸化后失活，釋放核轉錄因子E2F，游離的E2F啟動G1/S期轉換相關基因表達，推動細胞周期的進程。p16INK4a基因是CDKI基因家族成員，其產物p16INK4a蛋白可以特異性的與CDK4/CDK6結合，抑制CDK4/CDK6介導的視網膜母細胞瘤pRb的磷酸化，非磷酸化的Rb與轉錄因子E2Fs結合，進而阻止細胞由G1期進入S期啟動染色體的復制，使細胞周期停滯〔2〕。Krishnamurthy 等〔3〕提出 p16INK4a的表達能夠作為生理上的衰老的一個標志物。有研究表明，在衰老大鼠睪丸組織Rb基因和p16蛋白表達明顯增高，p-Rb蛋白表達明顯降低〔4，5〕。劉維潮等〔6〕研究顯示，在衰老大鼠腦組織p16蛋白表達較正常組明顯增高，p-Rb蛋白表達較正常組明顯降低。

另有研究〔7〕表明，在衰老的人成纖維細胞中CDKI因子增多，cyclinD mRNA水平比休眠細胞高很多倍，這必然導致過量的cyclinD產生，但多為無活性的cyclinD/CDK4復合物，而磷酸化cyclinD卻比休眠細胞少得多，而只有這種磷酸化的cyclinD才可以提高復合物的活性。衰老細胞中雖然CDK2總磷酸化水平不變，但cyclinD、E-CDK中的磷酸化水平卻下降，從而導致細胞停滯于G1期。

本研究提示D-半乳糖可能通過誘導cyclinD蛋白非磷酸化、提高p16蛋白含量以促進Rb蛋白磷酸化等多個環(huán)節(jié)加速了通過p16/cyclinD/CDK4-CDK6/Rb/E2F途徑對Rb蛋白的非磷酸化，阻滯細胞增殖，導致衰老。

綜上，D-半乳糖誘發(fā)的大鼠下頜下腺細胞衰老與Rb/p16細胞轉導通路的阻滯密切相關。

1 王 芳，關云謙.p16ink4a/p14ARF基因在細胞衰老和腫瘤抑制中的作用研究進展〔J〕.首都醫(yī)科大學學報，2011;32(1):100-5.

2 Lea NC，Orr SJ，Stoeber K，et al.Commitment point during Go-G，that controls entry into the cell cycle〔J〕.Mol Cell Biol，2003;23(7):2351-61.

3 Krishnamurthy J，Torrice C，Ramsey MR，et al.Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging〔J〕.J Clin Invest，2004;114:1299-307.

4 牛嗣云，陳 龍，高福祿，等.P53PRb細胞轉導通路相關基因和蛋白在衰老大鼠睪丸組織的表達〔J〕.解剖學報，2008;39(6):841-4.

5 牛嗣云，龐曉靜，高福祿，等.松花粉對衰老大鼠睪丸p53/Rb細胞轉導通路相關基因和蛋白表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(14):1780-2.

6 劉維潮，王 靜，王雙輝，等.何首烏飲對衰老大鼠腦組織Rb細胞轉導通路相關蛋白表達的影響〔J〕.承德醫(yī)學院學報，2009;26(4):454-5.

7 Dulic V，Drullinger LF.Altered regulation of G1 cyclin in senescent human diploid fibroblasts〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1993;90:11034.