來氟米特對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠神經(jīng)功能及血CD4+CD25+T淋巴細胞的影響

劉曉玲 由 瑋 左玲蓮 宋明君 劉桂霞 石 磊 陳永清 孫德萬

(煙臺市萊陽中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 萊陽 265200)

多發(fā)性硬化(MS)是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的炎性脫髓鞘 性疾病，其病因和發(fā)病機制復雜，一般認為是遺傳易感個體與環(huán)境因素相互作用而發(fā)生的自身免疫性疾病，以髓鞘脫失、神經(jīng)膠質(zhì)增生、不同程度的軸索病變和進行性神經(jīng)功能紊亂為主要特點〔1〕。實驗性自身免疫性腦脊髓炎 (EAE)的病理學、免疫學和臨床表現(xiàn)都與MS極為相似，因而成為公認的研究MS免疫病理學機制及其實驗性治療的最佳動物模型〔2〕。CD4+CD25+T細胞是調(diào)節(jié)性T細胞的亞群之一，能抑制自身反應(yīng)性T、B細胞的活化增殖以及免疫球蛋白的產(chǎn)生〔3〕。大量實驗表明CD4+CD25+T細胞的減少或功能降低會導致自身免疫性疾病的發(fā)生。來氟米特(LEF)是一種化學結(jié)構(gòu)獨特、作用機制新穎的新型免疫抑制劑，具有免疫抑制及抗增殖作用，與其他免疫抑制劑相比，具有多環(huán)節(jié)作用(抑制嘧啶合成，抑制蛋白酪氨酸激酶活性等)的特點，并具有抗病毒作用。現(xiàn)臨床主要用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎〔4〕、系統(tǒng)性紅斑狼瘡在內(nèi)的自身免疫性疾病;及免疫介導性疾病，如腎炎腎病、移植排異反應(yīng)等〔5〕，在風濕病、腎臟病、皮膚病、器官移植領(lǐng)域有廣闊的臨床應(yīng)用前景。本研究采用EAE大鼠作為動物模型，給予不同劑量LEF及甲潑尼龍治療，觀察藥物對大鼠神經(jīng)功能及血CD4+CD25+T細胞的影響，探討LEF治療EAE的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性Wistar大鼠100只，體重190～230 g，6～8周齡，由山東省中醫(yī)藥學校實驗動物中心提供;健康雌性豚鼠25只，體重300～400 g，由山東省中醫(yī)藥學校實驗動物中心提供。均于山東省中醫(yī)藥學校實驗動物中心動物房在恒溫22℃、相對濕度65% ～70%、光照周期12 h環(huán)境中，用標準混合飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后進入實驗。

1.2 主要試劑與儀器 LEF購自蘇州長征-欣凱制藥有限公司;甲潑尼龍購自大連輝瑞制藥有限公司;CD4-FITC單標抗體、CD4-FITC/CD25-PE雙標抗體以及相應(yīng)的對照抗體由美國BD公司提供。

1.3 方法

1.3.1 EAE大鼠模型制備

1.3.1.1 完全抗原的制備 取液體石蠟40 ml、羊毛脂20 g混合，加熱并融化制得不完全弗氏佐劑(IFA)，分裝入10 ml小瓶高壓滅菌后4℃冰箱保存。豚鼠用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射至四肢癱軟，無菌狀態(tài)下剪開胸腔、剝離心包，0.9%生理鹽水左心室灌注直至肝臟變白，迅速取其脊髓，小心剝離脊膜后稱重，加入等量生理鹽水，制成50%(W/V)全脊髓勻漿(GPSCH)。同時融化IFA，1 ml IFA加入約10 mg的卡介苗，即制得完全弗氏佐劑(CFA)。將CFA與GPSCH等體積混合，在冰上用注射器反復抽推，制成油包水乳液，制成完全抗原，放置冰上備用。

1.3.1.2 模型制備 健康雌性Wistar大鼠100只，隨機取12只作為正常對照組，其余88只進行造模。88只大鼠四肢足墊皮下及頸部皮下分別注射完全抗原(GPSCH/CFA)0.1 ml，即0.5 ml/只，足背皮內(nèi)注射百日咳桿菌抗原0.01 ml/只(含3.0×109個菌體);12只對照大鼠四肢足墊皮下及頸部皮下分別注射等量的生理鹽水/CFA乳液。免疫當日記為0 d。

1.3.2 動物模型鑒定

1.3.2.1 神經(jīng)功能評分 免疫當日和免疫后所有動物每日進行神經(jīng)功能評分(Duckers評分)〔6〕。0分：不發(fā)病;1分：尾部張力降低或輕度步態(tài)笨拙;2分：尾部無張力和(或)后肢中度無力;3分：雙側(cè)后肢麻痹;4分：后肢麻痹伴前肢力弱或麻痹;5分：因EAE而瀕臨死亡或死亡。評分≥1分為造模成功。

1.3.2.2 腦、脊髓組織病理檢查 模型大鼠采用10%水合氯醛腹腔麻醉后灌注處死。分別取脊髓頸膨大、胸段、腰膨大及全腦，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋、切片，HE染色后光鏡觀察。

1.3.3 實驗分組及給藥方法 造模成功且存活的大鼠共50只，與12只對照大鼠共分為5組，按以下方法給藥。LEF大劑量組：0.3 mg·kg－1·d－1灌胃給藥;LEF 小劑量組：0.2 mg·kg－1·d－1灌胃給藥;甲潑尼龍組：30 mg·kg－1·d－1尾靜脈注射給藥;模型組：等量生理鹽水灌胃;對照組：等量生理鹽水灌胃。給藥時間均為14 d。

1.3.4 神經(jīng)功能評分 給藥后每天觀察記錄神經(jīng)功能評分(Duckers評分)。

1.3.5 血CD4+CD25+T淋巴細胞比例觀察 給藥后第15天，將大鼠以水合氯醛腹腔麻醉后，心臟穿刺取血，EDTA抗凝。取抗凝全血各 100 μl，分別加入 CD4-FITC 10 μl、CD4-FITC 和CD25-PE各10 μl，混勻后室溫避光孵育20 min，陰性對照均以同型抗體代替。然后加入1∶10溶血素(FACS溶解液)2 ml，迅速于混旋器上混勻，置室溫處放置10 min，以2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入PBS液2 ml洗滌，以2 500 r/min離心5 min;棄上清液，加入0.5 ml PBS混勻后上流式細胞儀，檢測CD4+T細胞、CD4+CD25+T細胞的百分數(shù)。

1.3.6 腦、脊髓組織病理檢查 心臟取血后立即心臟灌注處死動物，取脊髓及全腦，HE染色后光鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件行方差分析，各組數(shù)據(jù)以s表示，進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 EAE發(fā)病動物的神經(jīng)功能狀況 經(jīng)生理鹽水/CFA免疫的12只對照大鼠未出現(xiàn)癥狀，體重持續(xù)增長，活動度正常。經(jīng)完全抗原免疫的88只大鼠有64只發(fā)病，其中1分16只;2分14只;3分14只;4分6只;5分14只，發(fā)病率為72.1%。麻醉意外及免疫后急性期死亡8只，評分5分的大鼠在發(fā)病達高峰時死亡。造模成功且存活的大鼠為50只，免疫后第12天首例出現(xiàn)臨床癥狀，以后發(fā)病數(shù)逐漸增多，多數(shù)在12～15 d出現(xiàn)癥狀，癥狀出現(xiàn)后3～4 d發(fā)病達高峰。癥狀先表現(xiàn)為尾部張力減低，隨后出現(xiàn)活動減少、食欲不振、體重下降明顯、毛色晦暗、雙后肢麻痹，嚴重者發(fā)展為四肢癱瘓、喂食時咀嚼無力、不能進水、尿便障礙至瀕臨死亡。

2.2 治療后EAE發(fā)病動物的神經(jīng)功能狀況 用藥治療后，EAE大鼠臨床癥狀逐漸緩解，麻痹、癱瘓的四肢逐漸恢復，攝食攝水量增多，活動增加甚至活動靈敏度接近正常。模型組大鼠癥狀可在造模第20天后開始自行緩解，緩解速度及程度較治療組小。隨著臨床癥狀的緩解，EAE大鼠體重也逐漸增加。

2.3 病理學改變 造模成功的EAE大鼠組織病理學主要表現(xiàn)為急性血管炎改變，脊髓實質(zhì)內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下腔及側(cè)腦室脈絡(luò)叢小血管充血，管周有大量炎細胞浸潤，形成“血管套”樣改變。腦部的炎性灶主要分布于白質(zhì)內(nèi)，如丘腦髓紋、視交叉上方、胼胝體等部位，在腦室周圍可見不規(guī)則的壞死區(qū)。脊髓的損害較腦為重，以腰骶段最為顯著，白質(zhì)較灰質(zhì)明顯。對照組的神經(jīng)組織病理檢查未見異常，這與此組未出現(xiàn)臨床癥狀吻合。治療后各治療組大鼠腦和脊髓組織病理學改變與模型組相比，均有不同程度減輕，病灶區(qū)域的炎性浸潤細胞數(shù)及“血管套”樣改變明顯少于模型組，以LEF大劑量組改變最明顯(圖1)。

2.4 治療后各組血CD4+T細胞、CD4+CD25+T細胞的百分率比較 見表1。

圖1 EAE大鼠脊髓(HE，×200)

表1 各組大鼠治療后血CD4+T細胞、CD4+CD25+T細胞的百分率比較(%，s)

表1 各組大鼠治療后血CD4+T細胞、CD4+CD25+T細胞的百分率比較(%，s)

與對照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與模型組比較：3)P ＜0.01

組別 n CD4+T CD4+CD25+T LEF大劑量組 12 36.18±1.901)3) 3.44±0.052)3)12 33.31±2.31 3.75±0.06 LEF小劑量組 12 42.07±1.692)3) 2.31±0.111)2)甲潑尼龍組 12 43.12±2.492)3) 2.31±0.051)2)模型組 14 46.47±2.182) 2.20±0.042)對照組

3 討論

EAE是在實驗動物發(fā)生的、局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫反應(yīng)，是CD4+T細胞介導的以特異性攻擊髓鞘的自身抗原引起神經(jīng)髓鞘損傷為特點的神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病。EAE具有與人類MS極為相似的病理學、免疫學和臨床特征，成為研究MS的理想動物模型。國內(nèi)外學者對EAE模型進行了較多研究〔7〕。本實驗造模成功后腦脊髓組織切片HE染色可見急性血管炎伴周圍髓鞘脫失，小靜脈周圍有大量炎細胞浸潤，形成血管鞘，白質(zhì)多于灰質(zhì)，與國內(nèi)外報道基本一致。

MS現(xiàn)在多用糖皮質(zhì)激素作為急性發(fā)作期的治療，但短期應(yīng)用激素對MS長期功能恢復并無明顯療效。環(huán)孢素、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤對進展型MS很可能有一定治療作用，但長期應(yīng)用副作用較大。免疫球蛋白靜滴治療可縮短病程、加速神經(jīng)功能恢復，但價格昂貴，且對多次復發(fā)者和進展型MS效果不理想。在MS發(fā)病機制及病情演化中，細胞免疫與體液免疫均參與了病理免疫過程，免疫異常及免疫細胞的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)是其發(fā)病的機制，因此應(yīng)用免疫抑制類藥物是MS治療的主要手段。

LEF是一種新型免疫抑制劑，其免疫抑制作用機制主要表現(xiàn)在兩個方面：(1)抑制嘧啶的從頭合成途徑，阻斷淋巴細胞的活化和增殖過程。LEF通過抑制嘧啶從頭合成途徑的關(guān)鍵酶-二氫乳清酸脫氫酶來阻斷嘧啶的從頭合成途徑〔8〕。(2)抑制酪氨酸激酶的活性，阻斷細胞炎癥信號的級聯(lián)傳導過程〔9〕。鑒于上述兩種獨特的作用機制，國外許多學者將該藥稱為“雙重作用免疫抑制劑”。另外，許多基礎(chǔ)實驗還表明，LEF還能夠直接抑制抗體的產(chǎn)生〔10〕，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-JB的活化等。LEF對多種自身免疫性疾病和免疫介導性疾病有確切的療效和良好的安全性，在風濕病、腎臟病、皮膚病、器官移植領(lǐng)域有廣闊的臨床應(yīng)用前景。LEF的不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為脫發(fā)、胃腸道反應(yīng)，但發(fā)生率較低，且程度較輕，表明LEF治療免疫性疾病是安全的，且相對于環(huán)孢素A、霉酚酸酯等而言，費用較低，能被大多數(shù)患者所接受，不失為經(jīng)一線免疫抑制劑治療無效患者的一種選擇。

CD4+CD25+T細胞是一類調(diào)節(jié)性細胞，是在胸腺細胞正常分化時由CD4+CD8+雙陽性細胞向CD4+CD8－單陽性細胞轉(zhuǎn)變過程中形成的，在抑制自身反應(yīng)性細胞增殖、維持免疫環(huán)境的穩(wěn)定方面起著重要作用。CD4+CD25+T細胞數(shù)量的減少、抑制功能的受損和(或)表面分子表達的缺陷，都可能導致自身免疫病的發(fā)生。Walker等〔11〕報道清除CD4+CD25+T細胞將導致大鼠發(fā)生自身免疫性疾病，推測可能是由于CD4+CD25+T細胞的減少導致EAE的發(fā)生。CD4+CD25+T細胞的免疫抑制機制主要有以下三種：(1)通過細胞接觸發(fā)揮抑制作用。這種抑制需要細胞表面的T細胞受體(TCR)活化，然后通過細胞表面的MHC分子進行直接抑制或通過抑制抗原提呈細胞(APC)表達協(xié)同刺激分子而進行間接抑制。(2)通過分泌抑制性細胞因子如IF-4、IF-10、TGF-β等發(fā)揮抑制作用。(3)通過競爭性抑制，效應(yīng)性T細胞與調(diào)節(jié)性T細胞通過競爭實現(xiàn)二者數(shù)量及功能上的動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)性T細胞可抑制效應(yīng)性T細胞由于抗原刺激引起的增殖，若抑制失敗則會發(fā)生MS等自身免疫性疾病，CD4+CD25+T細胞可協(xié)調(diào)這種動態(tài)平衡。近年來，Hori等〔12〕發(fā)現(xiàn)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在CD4+CD25+T細胞特異性表達，在CD4+CD25+T細胞的發(fā)育上起很重要的作用，無Foxp3的表達就沒有CD4+CD25+T細胞。Huan等〔13〕的研究證實MS患者的外周CD4+CD25+T細胞中Foxp3在信使RNA及蛋白水平上均有異常，這種細胞對機體的免疫抑制功能減退與其數(shù)量的衰減呈相關(guān)性，F(xiàn)oxp3水平的降低通過CD4+CD25+T細胞表現(xiàn)為機體免疫調(diào)節(jié)的功能障礙，這可能與MS直接相關(guān)。

本研究證明LEF作為一種免疫調(diào)節(jié)劑可以抑制CD4+T淋巴細胞增殖，降低CD4+T淋巴細胞百分數(shù)，同時可誘導 CD4+CD25+T細胞百分數(shù)增加，其機制可能與細胞間直接接觸及抑制性細胞因子IL-10、TGF-β等的參與有關(guān)，也可能是通過激活轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，增強CD4+CD25+T細胞活性來實現(xiàn)的，具體機制有待進一步闡明。

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