柯薩奇病毒B5巢式RT-PCR檢測方法的建立*

段晶晶，劉國華，黃學(xué)勇，李幸樂，王 芳，胡小寧1,，許汴利1,#

1) 鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州市疾病預(yù)防控制中心傳染病防治科 鄭州 450007 3) 河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 鄭州 450016 4)鄭州市兒童醫(yī)院感染性疾病科 鄭州 450053

近年來，河南省暴發(fā)多起病毒性腦炎，經(jīng)檢測主要由柯薩奇病毒B5(coxsackie virus B5, CVB5)引起[1]。CVB5是一種常見的能引起病毒性腦炎的腸道病毒，屬于腸道病毒屬小核糖核酸病毒，無包膜，單股正鏈RNA[2]，其引起的病毒性腦炎在我國廣泛存在[3-4]。病毒的分離培養(yǎng)與PCR擴(kuò)增測序是鑒定CVB5的主要方法和金標(biāo)準(zhǔn)，但由于該方法的敏感性和檢出率低、耗時長且費(fèi)用高，臨床上極少采用[5]，探索簡單、快速、靈敏度高的CVB5檢測方法非常有必要，為此，作者建立了檢測CVB5的巢式RT-PCR方法，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1毒株、試劑與儀器CVB5、Echo6、Echo25、EV71、CVA16毒株由河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病所實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)和保存。52份(血清16份，糞便19份，腦脊液17份)樣本采自臨床確診的病毒性腦炎病例。RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)；RT-PCR試劑盒和PCR反應(yīng)液(TaKaRa公司)，PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀(BIO-RAD公司)。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成從GenBank下載CVB5河南分離株全基因序列，進(jìn)行保守性分析，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，在VP1區(qū)設(shè)計(jì)巢式PCR引物，包括外引物P1：5’-GTGGAGAGGGCCATTGCACGCGTCG-3’，P2：5’-CAGTCACGCCAGTAGGTTCAAAAT-3’，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小約800 bp；內(nèi)引物P3：5’-TATGATGGGT GGGCTAGGTT-3’，P4：5’-TCTGTCACGCCAGTAGGT TC-3’，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小約200 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3標(biāo)本RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄按照RNA提取試劑盒說明書的操作步驟提取所有樣本RNA后，在Microtube管中加入dNTP Mixture和Random 6 mers各1 μL，已提取的RNA 2 μL，再加入RNase Free dH2O至終反應(yīng)體系為10 μL， PCR儀上65 ℃ 5 min進(jìn)行變性、退火。產(chǎn)物離心數(shù)秒后在該EP管中加入Prime ScriptTMBuffer 4 μL，RNase Inhibitor和Prime ScriptTMRTase各0.5 μL，RNase Free dH2O 5 μL，配置成20 μL反應(yīng)體系。反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。

1.4巢式PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化PCR反應(yīng)總體系為50 μL，每次反應(yīng)保持其他3個條件不變，分別以cDNA 模板梯度0.5、1.0、1.5、2.0 μL，上下游引物(25 μmol/L)梯度0.4、0.8、1.0、1.2、1.6 μL，退火溫度梯度50 ℃、53 ℃、56 ℃、59 ℃、62 ℃，循環(huán)數(shù)20、25、30、35個梯度循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后觀察成像結(jié)果，確定最適模板量、最佳引物量、最適退火溫度和最佳循環(huán)數(shù)。

1.5產(chǎn)物的檢測和鑒定取PCR反應(yīng)產(chǎn)物8 μL，用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳(180 V，30 min)。根據(jù)DNA Marker(DL2000)、陽性對照和陰性對照判定結(jié)果，使用凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。PCR反應(yīng)結(jié)果為陽性者委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序，用Blast程序進(jìn)行同源性鑒定。

1.6巢式RT-PCR的評價及臨床應(yīng)用①特異性：選用已經(jīng)過鑒定的5株不同的CVB5毒株和4株其他腸道病毒毒株(包括Echo6、Echo25、EV71、CVA16)及陰性對照(H2O)，用所建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證該方法的特異性。②敏感性：選用RD細(xì)胞進(jìn)行病毒效價滴定，得到CVB5標(biāo)準(zhǔn)株病毒濃度為6.32×107TCID50mL-1后，以其為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，分別得到1 000 TCID50，100 TCID50，10 TCID50，1 TCID50，10-1～10-9TCID50，用已建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增，取產(chǎn)物8 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以確定其敏感性。③重復(fù)性：將CVB5、Echo25、EV71等不同毒株及10份病毒性腦炎病例樣本分別用已建立的檢測方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,以判斷其重復(fù)性。對52個臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測時，分別以CVB5標(biāo)準(zhǔn)株和無菌水作為陽性和陰性對照。

2 結(jié)果

2.1巢式RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

最終確定2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系均為50 μL，包括PCR反應(yīng)液25 μL、cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、RNase Free dH2O 22 μL。在第2輪擴(kuò)增反應(yīng)中，取第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL作為第2輪的反應(yīng)模板。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。第2輪反應(yīng)條件除了將第1輪的30個循環(huán)改為25個循環(huán)外，其他與第1輪相同。

2.2擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定CVB5經(jīng)2輪擴(kuò)增，結(jié)果顯示第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物位于800 bp條帶處，第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物位于200 bp條帶處，且第2輪與第1輪相比條帶更加清晰，見圖1。測序及同源性分析結(jié)果顯示核苷酸同源性為100%，證明該擴(kuò)增產(chǎn)物的確是CVB5的VP1區(qū)基因片段。

2.3巢式RT-PCR的特異性第1輪擴(kuò)增，5株CVB5毒株均出現(xiàn)800 bp的目的條帶，且條帶清晰可見，無其他雜帶，而Echo6、Echo25、EV71、CVA16及陰性對照均無目的條帶，見圖2。第2輪擴(kuò)增，5株CVB5毒株在200 bp處均出現(xiàn)目的條帶，而其余4株病毒及陰性對照未見目的條帶，見圖3。結(jié)果與預(yù)期一致，證明該方法對CVB5毒株具有高度特異性。

圖1 2輪PCR反應(yīng)的電泳結(jié)果

圖2 特異性實(shí)驗(yàn)第1輪擴(kuò)增結(jié)果

圖3 特異性實(shí)驗(yàn)第2輪擴(kuò)增結(jié)果

2.4巢式RT-PCR的敏感性第1輪PCR反應(yīng)的敏感性達(dá)到10 TCID50，見圖4。第2輪PCR反應(yīng)敏感性達(dá)到10-4TCID50，見圖5。

2.5巢式RT-PCR的重復(fù)性分別用已建立的檢測方法對CVB5、Echo25、EV71等不同毒株及10份病毒性腦炎病例樣本重復(fù)測定3次，所有結(jié)果均一致。

2.6臨床樣品檢測結(jié)果對52份病毒性腦炎樣本用所建立的巢式RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，其中有10份為陽性，陽性率為19.23%，分別為血清4份(4/16)、糞便3份(3/19)、腦脊液3份(3/17)，經(jīng)測序鑒定全部為CVB5。而用病毒分離VP1測序方法得到陽性僅6份，分別為血清2份、糞便3份、腦脊液1份，且均來自于巢式RT-PCR結(jié)果為陽性的10份樣本。

圖4 靈敏性實(shí)驗(yàn)第1輪擴(kuò)增結(jié)果

圖5 靈敏性實(shí)驗(yàn)第2輪擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

病毒性腦炎是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，嚴(yán)重威脅兒童的身心健康，臨床上主要由醫(yī)生根據(jù)患兒的癥狀體征、腦脊液和腦電圖檢查等進(jìn)行確診，但無法得到病原學(xué)診斷。病毒的分離培養(yǎng)是目前鑒定CVB5的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法存在操作繁瑣、耗費(fèi)時間長、病毒分離成功率低等問題[6]。PCR作為一種新的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，具有操作簡單、快速、靈敏度和特異度高、易標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，已被越來越多地用于腸道病毒的診斷[7]。該研究建立的巢式RT-PCR方法一般在5 h內(nèi)即能完成包括RNA提取在內(nèi)的CVB5的檢測，在采集當(dāng)天即可以出結(jié)果，從而節(jié)約了大量的時間、人力和物力，降低了經(jīng)濟(jì)成本。初步研究結(jié)果也顯示其特異性強(qiáng)，靈敏度達(dá)到10-4TCID50，且重復(fù)性好。用建立的巢式RT-PCR方法對臨床52份不同的病毒性腦炎樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果陽性的10份樣本經(jīng)測序鑒定全部為CVB5，而病毒分離方法僅顯示6份陽性(均來自已檢測為陽性的10份樣本)，說明該方法較病毒分離方法具有更高的靈敏度。

綜上所述，該研究建立的巢式RT-PCR檢測方法具有簡單快速、靈敏度和特異度高、重復(fù)性好且經(jīng)濟(jì)合理等特點(diǎn)，有效地解決了病毒分離方法存在的問題，為CVB5感染的流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測提供了一種更為快速、敏感和可靠的手段。但由于CVB5是RNA病毒，核酸極易降解，同時PCR極易造成標(biāo)本之間的污染，尤其是2次PCR反應(yīng)，因此實(shí)驗(yàn)操作中要保證標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作環(huán)境和嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)規(guī)程，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

[1] 黃學(xué)勇，許玉玲，李幸樂，等. 柯薩奇病毒B5河南分離株全基因組序列測定及分析[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2011,46(6)：868

[2] 李華，楊卉娟，柯華昕，等.一株柯薩奇病毒B組5型(Cox.B5)病毒的分離及VP1基因分析[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2011,40(9)：55

[3] 胡永峰，趙麗娜，董杰，等．中國薩科奇病毒B5的全基因組測序及其序列分析[J].病毒學(xué)報(bào)，2010，26(4)：283

[4] 王海巖，李巖，徐愛強(qiáng)，等. 柯薩奇B5病毒引起山東省一起無菌性腦膜炎暴發(fā)的鑒定及其親緣進(jìn)化分析[J].中華流行病學(xué)雜志，2010,31(1)：64

[5] 謝藝紅，董柏青.病毒性腦炎研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008,14(6)：382

[6] 沈建峰，蔣就喜. 病毒性腦炎的分子生物學(xué)診斷進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2010, 16(8)：1226

[7] Cheng MF, Chen BC, Huang TS, et al. Clinical application of reverse-transcription polymerase chain reaction and intravenous immunoglobulin for enterovirus encephalitis[J]. Jpn J Infect Dis, 2008，61(1)：18