人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療失代償期肝硬化的療效觀察

朱明慧，劉旭華，韓際奧，楊 柯，楊 璐，曹 巍#

1)鄭州人民醫(yī)院院士專家工作站 鄭州 450003 2)鄭州人民醫(yī)院檢驗科 鄭州 450003 3)鄭州人民醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450003

肝硬化是多種慢性肝病的終末期病理表現(xiàn)，其藥物治療效果不理想。近年來，干細(xì)胞技術(shù)作為一種新的治療方法逐漸應(yīng)用于臨床。雖然已有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝病并能改善肝功能的報道[1-2]，但治療對象、輸注途徑不盡相同。作者采用靜脈輸注人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療失代償期肝硬化，觀察治療前后各項指標(biāo)的變化，探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床治療效果。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇2010年10月至2011年12月在鄭州人民醫(yī)院消化內(nèi)科行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療的失代償期肝硬化患者22例(觀察組)及同期住院未行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療的失代償期肝硬化患者20例(對照組)，均符合2000年病毒性肝炎防治方案診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，肝功能Child-Pugh分級為B或C級。所選擇病例均行腹部超聲或MRI檢查證實有肝硬化及腹水。觀察組中男18例，女4例，年齡24～67(48.5±10.6)歲；乙肝肝硬化17例，丙肝肝硬化3例，酒精性肝硬化2例。對照組中男16例，女4例，年齡26～66(49.2±11.9)歲；病毒性肝硬化17例，酒精性肝硬化3例。

1.2人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的采集、分離培養(yǎng)與鑒定該技術(shù)已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的采集：臍帶來自鄭州人民醫(yī)院產(chǎn)科分娩的健康孕婦，分娩前檢測HBV、HCV、HIV等病原學(xué)指標(biāo)，并簽署知情同意書，建立健康檔案。操作時嚴(yán)格按照臍帶采集標(biāo)準(zhǔn)和要求進(jìn)行。分離培養(yǎng)：將新鮮臍帶放入大培養(yǎng)皿中，PBS沖洗2遍，洗去血污；去除羊膜和血管，將剩余組織剪成1 mm3大小的組織塊，放入培養(yǎng)皿中，加入Alpha-MEM培養(yǎng)基20 mL；放入體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天半量換液，此后每天觀察細(xì)胞并每隔3 d全量換液1次；細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿達(dá)70%～80%時，加2.5 g/L胰蛋白酶消化、傳代。鑒定：用2 g/L臺盼蘭染色、計數(shù)，判斷細(xì)胞存活率，同時行細(xì)菌、真菌、支原體檢測和流式項目檢測，結(jié)果顯示所獲細(xì)胞不表達(dá)CD31、CD34、CD45，強(qiáng)烈表達(dá)CD29、CD44、CD73。將存活率95%以上、數(shù)量1.0×108個以上的間充質(zhì)干細(xì)胞用生理鹽水100 mL重懸，制成細(xì)胞懸液。

1.3治療方法觀察組患者治療前均簽署知情同意書，且該技術(shù)的臨床應(yīng)用已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。治療前注射小劑量地塞米松預(yù)防過敏反應(yīng)，觀察組每周靜脈輸注制備好的懸浮臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞1次；干細(xì)胞治療后當(dāng)日起連續(xù)使用促肝細(xì)胞生長素3 d，連續(xù)輸注2周。2組患者常規(guī)治療基本一致，治療中根據(jù)情況進(jìn)行支持性治療。

1.4療效觀察觀察2組患者治療前及治療后4、8周的臨床癥狀、體征；采用日立7600全自動生化分析儀檢測2組患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)、白蛋白(albumin，ALB)、血肌酐(creatinine，CRE)和血氨(ammonia，AMM)等肝、腎功能；采用SYSMEX CA-1500全自動血凝儀檢測凝血酶原時間(prothrombin time，PT)和凝血酶原活動度(prothrombin activity，PTA)；行腹部超聲或CT檢查。對照組5例、觀察組6例有各時間點完整生化指標(biāo)檢測結(jié)果，2組各有8例有各時間點凝血指標(biāo)檢測結(jié)果，10例有完整臨床癥狀及體征變化的記錄。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。2組治療前后各指標(biāo)的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組患者治療前后生化指標(biāo)的比較見表1～3。

表1 2組治療前后AMM的變化 μmol·L-1

F組間=0.514，P=0.704；F時間=16.177，P=0.002；F交互=0.001，P=0.982。

表2 2組治療前后ALT和TBil水平的變化

ALT：F組間=0.001，P=0.978；F時間=52.672，P<0.001；F交互=4.297，P=0.033。TBil：F組間=0.063，P=0.804；F時間=4.832，P=0.015；F交互=1.140，P=0.319。

ALB：F組間=3.023，P=0.090；F時間=10.933，P<0.001；F交互=1.630，P=0.202。CRE：F組間=1.050，P=0.312；F時間=0.421，P=0.622；F交互=1.656，P=0.202。

2.2 2組治療前后凝血指標(biāo)的比較見表4。

2.3 2組治療前后臨床癥狀及體征的變化觀察組中10例患者在干細(xì)胞治療后8周腹水明顯減少或消失，患者乏力、納差情況也明顯好轉(zhuǎn)；有2例患者治療前反復(fù)發(fā)生肝性腦病，治療后8周檢查，未再發(fā)生肝性腦病。而對照組治療前后臨床癥狀及體征改善不太明顯。見表5。

表4 2組治療前后PT和PTA水平的變化

PT：F組間=0.054，P=0.819；F時間=41.070，P<0.001；F交互=2.735，P=0.082。PTA：F組間=0.015，P=0.905；F時間=40.881，P<0.001；F交互=0.201，P=0.708。

表5 2組治療前后臨床癥狀及體征的變化例

組別時間n腹水乏力納差肝性腦病對照組治療前101010103治療后4周108662治療后8周106452觀察組治療前101010102治療后4周104341治療后8周102120

2.4不良反應(yīng)觀察組患者均未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)及并發(fā)癥，僅有1例治療后出現(xiàn)低熱，體溫37.8 ℃，24 h內(nèi)自行緩解。

3 討論

肝硬化是一種常見的慢性肝病，是由一種或多種原因引起的肝臟損傷，具體表現(xiàn)為肝細(xì)胞彌漫性變性壞死，繼而出現(xiàn)纖維組織增生和肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生，使肝變形、變硬而導(dǎo)致肝硬化[4]。肝硬化失代償期是肝病的終末期階段，通常藥物治療效果不太顯著，肝移植是治療終末期肝病最有效的方法，但存在器官供體缺乏、價格昂貴、移植后排斥反應(yīng)多等弊病。

當(dāng)前最有效的治療手段是再造出充滿活力的肝細(xì)胞，替代那些已經(jīng)死亡、失去功能的細(xì)胞。近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞治療在很多領(lǐng)域顯示出較好的療效，如血液病、糖尿病足、神經(jīng)及免疫系統(tǒng)疾病等，用于終末期肝病的嘗試亦越來越多。研究[5-6]證實間充質(zhì)干細(xì)胞是一群中胚層來源的具有自我更新和分化能力的多能干細(xì)胞，在一定條件下可誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，并具有正常肝細(xì)胞功能，如分泌尿素和ALB等。有報道[7-8]經(jīng)鼠尾部靜脈移植一定數(shù)量的骨髓干細(xì)胞并不引起機(jī)體明顯的毒性反應(yīng)，還可以歸巢至肝臟并分化成肝細(xì)胞，但其分化率報道不一。所移植間充質(zhì)干細(xì)胞定居于肝臟，是否分化為正常肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞與肝臟是否受損傷有關(guān)，而與移植途徑和移植后的時間無明顯關(guān)系[9]。作者采用靜脈輸注人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療終末期肝病，因為外周血循環(huán)移植創(chuàng)傷最小且操作簡單，能最大程度減輕患者痛苦，并通過干細(xì)胞的歸巢能力達(dá)到治療效果。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，取材方便，對產(chǎn)婦及新生兒無損害；臍帶中的干祖細(xì)胞更原始，能體外大量擴(kuò)增；不存在組織配型和免疫排斥反應(yīng)。該研究中僅有1例患者出現(xiàn)發(fā)熱，充分證明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療的安全性。

該研究結(jié)果顯示，治療后4周和8周，2組肝、腎功能指標(biāo)如ALT、TBil、AMM及ALB水平等均有改善；凝血指標(biāo)中PT縮短，PTA增加。此外，2組臨床癥狀和體征均有改善，且觀察組優(yōu)于對照組，提示干細(xì)胞治療有效。

總之，采用干細(xì)胞治療后4、8周的療效觀察結(jié)果在一定程度上表明了干細(xì)胞治療的有效性和安全性，短期療效較好，長期療效如何還有待進(jìn)一步觀察。雖然干細(xì)胞治療不能給肝病患者帶來治愈性的效果，但可以在很大程度上控制肝硬化的進(jìn)展速度，提高肝硬化患者的生存質(zhì)量。

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