蘆丁鍺的抗氧化能力觀察

翟 巍，鄭賽飛，王素紅，翟廣玉#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)護(hù)理學(xué)院 鄭州 450052

蘆丁是從中藥槐米中提取出來(lái)的一種黃酮化合物，臨床上用于治療過(guò)敏性紫癜及各種因毛細(xì)血管脆性增加而引起的出血性疾病等[1-2],也用于治療高血壓和老年氣管炎等[3]。蘆丁的藥理作用廣泛，其活性主要?dú)w結(jié)于抗氧化性[4]。人體在新陳代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，當(dāng)這些自由基無(wú)法通過(guò)正常途徑及時(shí)被清除時(shí)，就會(huì)引發(fā)各種疾病。根據(jù)目前的研究[5]結(jié)果，大部分常見(jiàn)疾病幾乎都與氧自由基有關(guān)，包括心腦血管疾病、癌癥、老年癡呆癥等。最近的研究[6]表明，一些金屬離子與蘆丁生成的配合物不僅具有比蘆丁更高的清除活性氧自由基的能力，同時(shí)還具有更低的毒副作用[7]。鍺是具有重要生理活性的微量元素之一。作者將蘆丁與氧化鍺在堿性條件下反應(yīng)，得到蘆丁鍺配合物，并測(cè)定了其對(duì)DPPH自由基的清除作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器試劑：蘆丁(純度>95%，河南平輿馨星生化有限公司)，氧化鍺(分析純)，1，1-二苯基-2-苦基肼基自由基(DPPH)(上海晶純實(shí)業(yè)有限公司)，其他試劑均為分析純。儀器:UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2蘆丁鍺的制備參照文獻(xiàn)[8]的方法并加以改進(jìn)。取1 mmol(610 mg)蘆丁，加入25 mL乙醇，攪拌使完全溶解，加入預(yù)先溶于25 mL乙醇中的鍺溶液(1 mmol GeO2，2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 40% NaOH溶液，加熱、攪拌使完全溶解)，用適量鹽酸調(diào)節(jié)pH為8.5～9.0。于裝有攪拌器和冷凝管的三口燒瓶中加熱回流6 h。用硅膠G板監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程，待反應(yīng)完成時(shí)換成蒸餾，當(dāng)蒸餾出2/3 溶劑時(shí)，停止蒸餾。將反應(yīng)液裝入聚酰胺層析柱，先用水沖洗，再用乙醇溶液梯度洗脫，收集設(shè)定區(qū)間洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干有機(jī)溶劑得棕黃色固體，用乙醇重提，得深棕黃色固體。對(duì)其進(jìn)行紫外光譜分析。

1.3DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

1.3.1 DPPH溶液的配制 精密稱(chēng)取10 mg DPPH,置于250 mL容量瓶中，加入少量無(wú)水乙醇，待溶解后再用無(wú)水乙醇定容至刻度，混勻得1×10-4mol/L的DPPH溶液，避光于冰箱0～5 ℃保存。

1.3.2 供試液的配制 精密稱(chēng)取蘆丁鍺和蘆丁樣品適量，以乙醇為溶劑，分別配制100、 80、60、40和20 mg/L的樣品溶液。參照文獻(xiàn)[9]方法并加以改進(jìn)，行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)。精確吸取各樣品溶液1 mL，分別與 1×10-4mol/L的DPPH溶液3 mL混合，避光放置30 min，在517 nm處測(cè)吸光度Ay。以溶劑乙醇代替樣品溶液作為空白對(duì)照，所測(cè)得的吸光度為As。樣品溶液的吸光度為A0。DPPH自由基清除率按下式計(jì)算：

2 結(jié)果

2.1蘆丁鍺的紫外光譜分析蘆丁在359 nm和257 nm處有兩個(gè)吸收峰，分別對(duì)應(yīng)兩個(gè)生色團(tuán)：359 nm吸收帶由肉桂酰生色團(tuán)產(chǎn)生，為Ⅰ帶，屬于π → π*(B環(huán))電子躍遷；257 nm吸收帶由苯甲酰生色團(tuán)產(chǎn)生，為Ⅱ帶，屬于n→π*(A環(huán))電子躍遷[10]。當(dāng)蘆丁與鍺形成配合物后，由于鍺的作用，峰帶Ⅰ紅移至385 nm，而峰帶Ⅱ紅移至270 nm，見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁和蘆丁鍺的紫外光譜圖

2.2蘆丁鍺體外清除DPPH自由基的作用DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，在相同質(zhì)量濃度條件下，蘆丁鍺的DPPH自由基清除率大于蘆丁，蘆丁鍺與蘆丁的EC50分別是55.84和58.95 mg/L。

表1 蘆丁及蘆丁鍺的DPPH自由基清除率比較(n=3)

3 討論

黃酮類(lèi)物質(zhì)在抗氧化反應(yīng)中不僅可以清除鏈引發(fā)反應(yīng)中的活性自由基和起催化作用的金屬離子，還能直接捕捉鏈傳遞過(guò)程中的過(guò)氧自由基，阻斷鏈反應(yīng)，是很好的預(yù)防型和阻斷型抗氧化劑。人體內(nèi)的自由基主要有活性氧自由基，如·O2、·OH等。體外檢測(cè)清除自由基的方法以DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)。DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液在517 nm處有最大吸收，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于DPPH自由基的單電子被配對(duì)，從而使得在517 nm處的吸光度減小，因此該法常被用來(lái)評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。能清除DPPH自由基提示著能清除體內(nèi)的活性氧自由基，具有抗衰老作用。蘆丁鍺7位羥基比較活潑，容易失去一個(gè)電子，該位置上的自由基參與了更大的共軛體系，整個(gè)分子通過(guò)鍵移動(dòng)形成共振，從而大大增強(qiáng)了穩(wěn)定性。當(dāng)有自由基清除劑蘆丁鍺存在時(shí)，DPPH就會(huì)從蘆丁鍺中奪取一個(gè)電子，DPPH自由基的單電子被配對(duì)變成DPPHH，形成穩(wěn)定的分子。

作者將蘆丁與氧化鍺在堿性條件下合成了蘆丁鍺配合物。從紫外光譜圖上可看出，由于蘆丁鍺配合物的共軛體系增大，電子躍遷的能量減少，吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波移動(dòng)，即紅移，說(shuō)明形成了配合物，蘆丁鍺的共軛體系較蘆丁更大。DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘆丁鍺比蘆丁具有更好的自由基清除活性，因此也具有更好的抗氧化活性。進(jìn)一步說(shuō)明蘆丁在與鍺配位后，其清除DPPH自由基能力增強(qiáng)，這可能與形成配合物后，分子的共軛體系增大有關(guān)。

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