磷酸肌酸鈉對缺氧窒息幼鼠腎組織HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響

劉月梅，陳 瑩，李永鳳，劉春艷

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科 鄭州 450014

腎臟血流分布的特點(diǎn)及其所執(zhí)行的高耗能的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝功能，致使腎髓質(zhì)等部位會出現(xiàn)顯著的氧張力下降[1]。而幼鼠腎組織結(jié)構(gòu)及功能發(fā)育尚不成熟，因此，其腎臟更易受到缺氧缺血的影響。在缺氧缺血損傷過程中，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)高表達(dá)并調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等多個靶基因，參與缺氧細(xì)胞的能量代謝和氧利用障礙的發(fā)生機(jī)制[2]。磷酸肌酸鈉(creatine phosphate sodium，PCr)是人體內(nèi)自有的活性物質(zhì)，參與細(xì)胞能量代謝，其主要的功能是既可作為高耗能細(xì)胞ATP濃度恒定的“緩沖劑”，又可作為細(xì)胞內(nèi)的能量載體。目前常用的PCr是人工合成的高效低毒的心肌保護(hù)藥，已廣泛應(yīng)用于多種心臟疾病的治療過程且有較好療效[3-4]。該實(shí)驗(yàn)通過觀察缺氧窒息幼鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化及應(yīng)用PCr后腎組織HIF-1α和VEGF表達(dá)的變化，探討PCr對腎臟缺氧性損傷的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器HIF-1α鼠抗人單克隆抗體、VEGF兔抗人多克隆抗體、β-actin多克隆抗體、DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)服務(wù)有限公司)，PCr(1.0 g，吉林英聯(lián)生物技術(shù)有限公司)，Trizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trans DNA Marker Ⅰ 、Taq DNA聚合酶(北京全式金生物有限公司)，引物(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，分光光度計(jì)、光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus 公司)，基因擴(kuò)增儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2動物分組及缺氧窒息模型制備3～4周齡的健康SD幼鼠24只(河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，體質(zhì)量70～85 g，雌雄不限，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：PCr干預(yù)組(PCr組)、模型組和正常對照組，每組8只。PCr組和模型組幼鼠制作缺氧窒息模型[5]：室溫18～22 ℃下，將幼鼠置于含有新鮮空氣、經(jīng)過標(biāo)定的500 mL廣口瓶內(nèi)，加橡皮塞密封30 min取出。正常對照組幼鼠放入廣口瓶中，不作缺氧處理。PCr組在制作缺氧窒息模型前0.5 h、缺氧窒息后即刻腹腔注射1.4 mg/g的PCr，模型組在相同時間點(diǎn)腹腔注射等體積的生理鹽水，正常對照組不作特殊處理。缺氧窒息后6 h，處死幼鼠，切取一側(cè)腎臟，剝離腎包膜和脂肪囊，將腎臟沿長軸縱向剖為兩半，一半固定于中性甲醛溶液中，24 h后脫水、石蠟包埋，4 ℃保存?zhèn)溆?；另一半用凍存管密封后，置于液氮中? h后取出放于-80 ℃冰箱中保存。

1.3腎組織病理形態(tài)觀察采用HE染色法。石蠟標(biāo)本作2～3 μm 厚連續(xù)切片。HE染色后，于200倍光鏡下觀察。

1.4腎組織HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)的檢測采用免疫組織化學(xué)SP法。免疫組織化學(xué)染色嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，陽性染色細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒。PBS代替一抗作陰性對照。采用全自動圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化分析，在400倍光鏡下，避開大血管和腎小球，每張切片至少隨機(jī)選取5個視野測量其積分光密度，取均值。

1.5腎組織HIF-1α和VEGFmRNA表達(dá)的檢測采用RT-PCR法。取出冰箱中保存的待檢標(biāo)本。HIF-1α引物序列：上游5’-TTACTGAGTTGATGGGT TA-3’，下游5’-TGTTTGTTGAAGGGAGAA-3’，擴(kuò)增片段大小296 bp。VEGF引物序列：上游5’-GGCAACACCAAGTCCGAATG-3’，下游5’-GTCTG GCTTCACAGCACTCT-3’，擴(kuò)增片段大小131 bp。β-actin引物序列：上游5’-TCAGGTCATCACTATCGG CAAT- 3’，下游5’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’，擴(kuò)增片段大小432 bp。按Trizol試劑盒說明提取腎組織總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA條件：42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 min。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物滴于20 g/L瓊脂糖凝膠上，電泳30 min后，紫外凝膠成像系統(tǒng)成像，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。以目的基因DNA條帶與β-actin DNA條帶灰度值的比值作為目的基因mRNA的表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)。3組幼鼠腎組織HIF-1α 、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組幼鼠腎組織病理形態(tài)變化見圖1。正常對照組幼鼠腎組織未見明顯的病理形態(tài)改變；模型組損傷嚴(yán)重，可見腎小管上皮細(xì)胞腫脹，大量炎性細(xì)胞浸潤，部分上皮細(xì)胞變性壞死，腎小球出現(xiàn)水腫、甚至固縮；PCr組幼鼠腎小管和腎小球受損狀況明顯減輕，但與正常對照組相比仍可見有不同程度的病理改變。

2.2各組幼鼠腎組織HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)見圖2、表1。

2.3各組幼鼠腎組織HIF-1α和VEGFmRNA的表達(dá)見圖3、表1。

表1 各組幼鼠腎組織HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白的表達(dá) (n=8)

*與正常對照組相比，P<0.05；#與PCr組相比，P<0.05。

圖1 各組幼鼠腎組織病理形態(tài)變化(HE，×200)

圖2 各組幼鼠腎組織HIF-1α(A)和VEGF(B)蛋白的表達(dá)(SP，×400)

圖3 各組幼鼠腎組織HIF-1α(上)和VEGF(下) mRNA的表達(dá)情況

3 討論

機(jī)體發(fā)生缺氧窒息時各臟器血流重新分布，為保證心腦等重要臟器的血供，腎臟等內(nèi)臟器官血管收縮，血流灌注減少，因此缺氧窒息后腎損害的發(fā)生率顯著高于其他器官[6-7]。HIF-1是介導(dǎo)細(xì)胞缺氧適應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是由缺氧敏感的α亞單位和結(jié)構(gòu)性的β亞單位組成的異二聚體，其中HIF-1α受缺氧信號的調(diào)控，常氧條件下，HIF-1α極易通過泛素-蛋白水解酶系統(tǒng)被降解，故機(jī)體僅有少量表達(dá)[8]。缺氧條件下，HIF-1α大量聚集，增強(qiáng)細(xì)胞對缺氧環(huán)境的適應(yīng)能力，使細(xì)胞免遭缺氧造成的損傷，另外，還可與HIF-1β組成穩(wěn)定的異二聚體，移入核內(nèi)，通過與VEGF等多個靶基因的調(diào)控序列即缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，啟動靶基因轉(zhuǎn)錄。VEGF是一種在組織缺氧后與誘導(dǎo)新生血管生成密切相關(guān)的因子，在缺血組織微循環(huán)的建立恢復(fù)過程中起重要作用。Kuwabara等[9]發(fā)現(xiàn)HIF-1α可作用于誘導(dǎo)型NO合成酶，誘導(dǎo)NO合成增加，NO可直接刺激VEGF表達(dá)，誘導(dǎo)新生血管的生成，在腎臟的缺氧性損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。HIF-1α還可通過結(jié)合促紅細(xì)胞生成素、血紅素加氧酶-1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1等編碼基因的缺氧反應(yīng)元件而增強(qiáng)其靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，參與缺氧細(xì)胞的能量代謝等發(fā)生機(jī)制[2]，使缺氧的組織細(xì)胞保持氧穩(wěn)態(tài)及耐受低氧狀態(tài)而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，具有明確的腎小管細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)[10-11]。Bruick[12]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α缺失后，凋亡細(xì)胞的數(shù)量也明顯減少，提示HIF-1α還可能具有凋亡誘導(dǎo)作用。該研究結(jié)果表明，PCr和模型組幼鼠腎組織HIF-1α和VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)均較正常對照組升高，提示HIF-1α和VEGF在幼鼠缺氧窒息病理損傷中起到重要的作用。

磷酸肌酸主要在腎臟合成，在能量代謝中起到儲存和轉(zhuǎn)運(yùn) ATP 的雙重功能。PCr是一種為機(jī)體提供能量的制劑，在缺氧情況下，注入機(jī)體的PCr可被迅速分解提供能量，抑制酸性有毒物質(zhì)的大量產(chǎn)生聚集，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞的修復(fù)和功能的改善。PCr在缺氧條件下應(yīng)用，可誘導(dǎo)機(jī)體啟動內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，使機(jī)體在短時間內(nèi)快速產(chǎn)生自身保護(hù)，器官組織在隨后較長時間對缺氧缺血產(chǎn)生耐受，減輕臟器損傷[13-14]。外源性PCr還可以降低氧自由基的產(chǎn)生，減輕細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，穩(wěn)定細(xì)胞膜，有助于血紅蛋白與組織間的氧氣交換，增加缺氧組織對氧的利用，提高組織的含氧量，減少細(xì)胞凋亡[15-16]，從而發(fā)揮保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞的作用。該研究結(jié)果顯示PCr組與模型組相比，腎組織病理改變減輕，HIF-1α、VEGF的表達(dá)降低。

綜上所述，幼鼠在缺氧窒息后腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變，HIF-1α和 VEGF表達(dá)升高，PCr能夠降低腎組織HIF-1α、VEGF的表達(dá)，增加缺氧組織對氧的利用，減輕過氧化損傷。

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