纈沙坦對大鼠急性心肌梗死后F-肌動蛋白與熱休克蛋白27表達的影響

陳 杰，張麗華，牛少輝

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450014

心肌梗死(myocardial infarction，MI)后心室重構(gòu)(ventricular remodeling，VRM)涉及多因素的復(fù)雜調(diào)控，細胞骨架蛋白包括其蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的各個成分，起著維系心肌形態(tài)的關(guān)鍵作用，骨架的變化必然引起心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變，導(dǎo)致VRM的發(fā)生發(fā)展。血管緊張素受體拮抗劑(angiotensin receptor blockades，ARBs)通過全面阻斷肥厚刺激性因素血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的作用而改善VRM，降低MI的發(fā)病率及病死率[1]，但對MI后心肌纖維化和細胞骨架蛋白的作用仍處于探索階段。該研究以MI大鼠為模型，通過測定梗死后心肌組織中熱休克蛋白27(HSP27)、F-肌動蛋白(F-actin)蛋白和mRNA的表達和變化，探討纈沙坦對大鼠MI后細胞骨架蛋白的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1主要材料健康成年雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量220～250 g，由河南省實驗動物中心提供。兔抗HSP27、F-actin多克隆抗體購自鄭州博瑞生物科技有限公司；HSP27、F-actin和β-actin(內(nèi)參)引物購自北京博大泰克公司。纈沙坦片，80 mg/片(國藥準(zhǔn)字J20070026，進口藥品注冊證號BH20060395)。Hx-100E小動物呼吸機購自成都豢肇科技公司；基因擴增儀購自Eppendorf公司；nYY-6c型電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2大鼠MI模型制作及分組Wistar大鼠采用隨機數(shù)字表法分為MI組、纈沙坦組(X組)、正常對照組(N組)、假手術(shù)組(SH組)，每組15只。大鼠經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛溶液300 mg/kg麻醉滿意后，固定于手術(shù)臺上，并連接心電圖肢體導(dǎo)聯(lián)。備皮、消毒，在第4肋間處做一橫行切口，逐層分離皮下組織及胸大肌，至暴露出肋骨及肋間肌，此時接呼吸機，打開胸腔、暴露心臟、剪開心包、擠出心臟，以無損傷縫合針在左心耳與肺動脈圓錐之間穿過冠狀動脈前降支，并將縫線扎緊。心電圖顯示Ⅰ和avL導(dǎo)聯(lián)ST段呈弓背向上抬高提示手術(shù)成功。SH組只在相同部位穿線，不結(jié)扎，其余步驟同手術(shù)組[2]。術(shù)后X組每天給予纈沙坦15 mg/kg(溶于1 mL生理鹽水)灌胃，另3組給予等體積生理鹽水灌胃，灌胃4周。

1.3心臟標(biāo)本提取和處理經(jīng)4周喂養(yǎng)后，MI組存活大鼠11只，X組存活13只，SH組和N組存活15只。將存活大鼠頸椎脫臼處死，取左心室前壁MI區(qū)為標(biāo)本。

1.4心肌組織形態(tài)學(xué)分析在體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中固定心肌組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，6 μm厚連續(xù)切片，分別進行HE染色、鏡檢。

1.5心肌組織HSP27、F-actin蛋白表達的免疫組化檢測采用免疫組化SP方法，具體步驟按照試劑盒說明操作，DAB顯色。用已知陽性切片作為陽性對照，0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察，棕黃色顆粒為HSP27、F-actin陽性表達。每張切片取5個400倍視野進行圖像采集，應(yīng)用Biosens Digital Imaging System v1.6對所采集照片的相關(guān)免疫組化染色的光密度值進行測量，重復(fù)3次，取平均值。

1.6心肌組織HSP27和F-actinmRNA表達的檢測每只大鼠分別取100 mg心臟組織，加入Trizol液 1 mL中研磨吹打成勻漿后抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Transgene公司產(chǎn)品)。引物序列為：HSP27(262 bp)，上游5’-TGGACAATGG CAAGGTAGCG-3 ’，下游5’-TGGGCAATGGGTTGGT AATC-3’；F-actin(700 bp)，上游5’-GCTAAGAAGG CGATACAA-3’，下游5’-AGAATGAGGACTGGGTG A-3 ’。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取5 μL擴增產(chǎn)物與緩沖液混合后經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進行分析，目的基因mRNA的表達量以目的基因條帶和β-actin條帶灰度值比值計算。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。4組間F-actin、HSP27蛋白和mRNA表達的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；各組F-actin、HSP27蛋白和mRNA相對表達量間采用Pearson積差相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1心肌組織形態(tài)學(xué)觀察4周后組織切片HE染色顯示：N組和SH組心肌細胞排列整齊，無肌纖維破壞，細胞質(zhì)豐富均勻，心肌細胞間隙正常；MI組心肌細胞排列紊亂，心肌組織受損，可見心肌細胞廣泛水腫，心肌細胞間隙明顯增寬，膠原纖維增生顯著，梗死區(qū)周邊可見有新生血管形成；X組心肌細胞排列及膠原纖維增生程度介于N組與MI組(圖1)。

2.2免疫組化結(jié)果免疫組化染色示，N組和SH組可見微量的棕黃色顆粒沉著，主要分布于細胞周邊；MI組可見大量的棕黃色顆粒，主要分布于細胞中央；X組可見中等量棕黃色顆粒，周邊和中央均有分布。結(jié)果見圖2，表1。

圖1 各組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)變化(HE，×400)

圖2 F-actin和HSP27蛋白的免疫組化染色結(jié)果(SP，×400)

2.3RT-PCR結(jié)果見圖3，表2。

2.4相關(guān)性分析結(jié)果MI組中F-actin和HSP27蛋白表達量呈正相關(guān)(r=0.807，P=0.003)，F(xiàn)-actin和HSP27 mRNA表達量呈正相關(guān)(r=0.615，P=0.044)；X組中F-actin和HSP27蛋白表達量呈正相關(guān)(r=0.805，P=0.001)，F(xiàn)-actin和HSP27 mRNA表達量呈正相關(guān)(r=0.762，P=0.002)。N組和SH組F-actin和HSP27 mRNA表達量無關(guān)(r=-0.035，P=0.902；r=-0.455，P=0.088)；F-actin和HSP27蛋白表達量無關(guān)(r=0.218,P=0.436;r=-0.170,P=0.564)。

圖3 F-actin與HSP27 mRNA電泳結(jié)果

組別nF-actin蛋白HSP27蛋白MI組112.216±0.022?2.230±0.026?X組132.132±0.014?#2.140±0.014?#SH 組151.972±0.029#2.036±0.017#N組151.988±0.026#2.023±0.020#F310.587312.760P<0.001<0.001

*與SH組比較，P<0.05；#與MI組比較，P<0.05。

表2 各組大鼠心肌組織F-actin和HSP27 mRNA相對表達量比較

*與SH組比較，P<0.05；#與MI組比較，P<0.05。

3 討論

細胞骨架由微絲、中間絲和微管及相關(guān)的骨架蛋白組成[3]，其中微絲主要由3類蛋白質(zhì)組成：actin、肌球蛋白和actin結(jié)合蛋白。actin有球狀單體(G-actin)和絲狀聚合體(F-actin)2種形式，F(xiàn)-actin為雙螺旋狀的微絲，是由多個相對分子質(zhì)量為 42 000 的球狀單體以非共價鍵結(jié)合形成的2條多聚體單鏈，G-actin不斷地加入或脫落，使F-actin保持著聚合和解聚的動態(tài)平衡，維持細胞骨架的形態(tài)和功能[4]。單體和聚合體之間的平衡轉(zhuǎn)換與其對細胞功能的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，當(dāng)各種致病因素打破這種平衡后，F(xiàn)-actin發(fā)生聚合和重排，細胞周邊的actin環(huán)斷裂，細胞中央出現(xiàn)大量呈束狀密集排列的應(yīng)力纖維，這時細胞中心張力增加使細胞逐漸收縮，細胞間隙增大、增多，最終導(dǎo)致通透性升高[5]，致使細胞骨架重構(gòu)，功能受損。HSP27是HSP家族的成員之一，除具有分子伴侶活性，還是一種重要的actin結(jié)合蛋白，有調(diào)控actin細胞骨架方面的作用[6]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)以單聚體、非磷酸化狀態(tài)存在的HSP27作為帽狀蛋白結(jié)合在F-actin的5’端，它通過抑制actin的聚合，進而達到穩(wěn)定和保護actin細胞骨架的作用[7]。AngⅡ和熱刺激可以誘導(dǎo)高水平的HSP27的表達[8-9]。纈沙坦是ARBs，在調(diào)節(jié)全身血壓、改善VRM方面起關(guān)鍵作用。近年來AngⅡ成為細胞骨架與重構(gòu)方面的研究熱點。張進[1]研究表明MI 4周后AngⅡ明顯增高，可能是心肌病理性肥大和VRM始動的分子機制之一。劉敬[10]研究表明AngⅡ通過p38MAPK/HSP27信號通路的激活，誘導(dǎo)細胞骨架F-actin重排，導(dǎo)致應(yīng)力纖維形成。

該實驗結(jié)果顯示，光鏡下HE染色示N組和SH組心肌細胞排列整齊，無肌纖維破壞；MI組心肌細胞排列紊亂，膠原纖維增生顯著；X組可見心肌細胞排列及膠原纖維增生程度介于N組與MI組。提示心肌組織重構(gòu)是梗死后重要病理變化。免疫組化與RT-PCR結(jié)果顯示，與SH組比較，HSP27、F-actin蛋白和mRNA表達量在MI組和X組均升高；且MI組和X組HSP27和F-actin蛋白、mRNA的表達呈正相關(guān)。從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平提示，MI后F-actin蛋白含量增加，即聚合的actin增多導(dǎo)致細胞骨架出現(xiàn)重構(gòu)，可能是致使心肌重構(gòu)功能受損的重要的病理生理機制。而X組細胞骨架蛋白受損程度較輕，F(xiàn)-actin蛋白和mRNA表達量較MI組低，提示纈沙坦通過拮抗F-actin蛋白的表達保護骨架正常功能，可能是纈沙坦保護梗死后心肌功能的一個重要機制。HSP27和F-actin蛋白、mRNA的表達呈正相關(guān)，提示HSP27和F-actin蛋白在MI后細胞骨架的重構(gòu)、損傷的發(fā)生中可能起協(xié)同作用。

總之，該實驗初步表明，大鼠MI后心肌組織中F-actin、 HSP27表達增加，可能是導(dǎo)致細胞骨架受損、VRM的重要因素；纈沙坦干預(yù)后F-actin、 HSP27表達減少，VRM減輕。作者推測，MI后可能AngⅡ升高，通過激活p38MAPK/HSP27信號通路，使磷酸化的HSP27增多，磷酸化HSP27脫落進入胞質(zhì)，使HSP27在F-actin的5’端帽狀蛋白功能喪失，F(xiàn)-actin發(fā)生聚合和重排，從而造成應(yīng)力纖維和細胞間隙增加，導(dǎo)致細胞骨架重構(gòu)，功能受損。纈沙坦作為ARBs可以拮抗這一過程，從而保護細胞骨架，減少心肌細胞壞死，具體機制尚需要進一步探究。降低AngⅡ水平，抑制HSP27磷酸化，避免F-actin聚合重排，可能為MI的治療開辟新的領(lǐng)域，值得進一步研究。

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