霉酚酸酯對(duì)糖尿病大鼠腎組織中IGF-1、MMP-2表達(dá)的影響

李 敏，王建生，劉東偉

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科 鄭州 450014

隨著許多發(fā)展中國家生活方式和飲食習(xí)慣的西化，糖尿病(diabetes mellitus,DM)及糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)的發(fā)病率日趨升高，DN正成為發(fā)展中國家慢性腎臟病的主要病因。DN早期表現(xiàn)為腎臟體積增大、腎小球肥大和高濾過，其主要組織學(xué)改變是腎小球系膜基質(zhì)增生、系膜細(xì)胞增殖、腎小球毛細(xì)血管袢及腎小管基底膜增厚[1-2]?；A(chǔ)研究[3-4]證實(shí)腎臟局部胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)積聚和基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)活性降低在腎小球系膜基質(zhì)生成與降解失衡過程中起重要作用。霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)是一種新型免疫抑制劑，已試驗(yàn)性的應(yīng)用于DN的臨床治療，但確切機(jī)制尚不明確。作者觀察了早期DM大鼠腎組織中IGF-1和MMP-2的表達(dá)情況，探討MMF對(duì)DM大鼠腎臟的保護(hù)作用及可能存在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠36只(由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量200～220 g，實(shí)驗(yàn)過程中飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣籠具中(河南省中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)，籠具內(nèi)條件：溫度(22±1) ℃，相對(duì)濕度(55±5)%，晝夜明暗交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑與藥品鏈脲菌素(STZ，美國Sigma公司)，用前溶于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=4.5)中；MMF(杭州中美華東制藥有限公司)用前溶解于二甲基亞砜(美國Sigma公司)中，并用5 g/L羧甲基纖維素鈉(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)配至所需濃度；SP法試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；兔抗大鼠IGF-1、MMP-2多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(美國 Jackson公司)；PVDF轉(zhuǎn)印膜(美國Pall公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司)。

1.3動(dòng)物模型的建立及分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組(n=12)和模型組(n=24)，大鼠過夜禁食大于17 h，自由飲水，血糖儀(美國強(qiáng)生公司)測空腹血糖后，模型組以STZ 55 mg/kg一次性腹腔注射，對(duì)照組按體質(zhì)量給予相當(dāng)量枸櫞酸緩沖液腹腔注射。48～72 h后測隨機(jī)血糖，≥16.7 mmol/L為大鼠DM模型誘導(dǎo)成功[5-6]。模型組中3只大鼠血糖未達(dá)標(biāo)，剔除后，按隨機(jī)原則分為DM組(n=11)和MMF組(n=10)。每日8：00時(shí)MMF組給予MMF 15 mg/kg灌胃，對(duì)照組和DM組按體質(zhì)量給予相當(dāng)量溶媒灌胃。所有大鼠實(shí)驗(yàn)期間(8周)自由進(jìn)食、飲水，不應(yīng)用胰島素。

1.4標(biāo)本采集各組動(dòng)物處死前置于代謝籠中，準(zhǔn)確收集24 h尿液，測24 h尿蛋白、尿肌酐(全自動(dòng)生化分析儀)。稱體質(zhì)量后戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，測血糖(強(qiáng)生血糖儀)、血肌酐(全自動(dòng)生化分析儀)，計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)。4 ℃生理鹽水反復(fù)灌洗腎臟后，游離左腎，稱質(zhì)量，計(jì)算相對(duì)腎質(zhì)量(左腎質(zhì)量/體質(zhì)量)。然后沿腎門縱向剖開，置于體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋。游離右腎，冰上取腎皮質(zhì)切成小塊，立即置于液氮中，再轉(zhuǎn)入-70 ℃冰箱待測腎組織IGF-1、MMP-2。

1.5腎組織病理學(xué)觀察石蠟切片(3 μm厚)，常規(guī)脫蠟后，PAS染色，高倍鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。

1.6腎組織中IGF-1、MMP-2蛋白的免疫組化檢測采用SP法。兔抗大鼠IGF-1、MMP-2多克隆抗體均按100倍稀釋。德國Lecia顯微照像系統(tǒng)采集圖像，Biosens Digital Imaging System v1.6軟件分析圖像，每張切片高倍鏡下測定20個(gè)視野，測定陽性區(qū)平均積分光密度值，取均值作為該切片的結(jié)果。

1.7腎組織中IGF-1、MMP-2蛋白的Westernblot檢測稱取100 g腎組織置于裂解液中冰上勻漿，超聲粉碎，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法蛋白定量。取蛋白60 μg煮沸5 min，經(jīng)120 g/L SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜效果，50 g/L脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h，加入兔抗大鼠IGF-1、MMP-2多克隆抗體(均按 1 000 倍稀釋)，4 ℃過夜孵育，TBST搖床洗膜10 min×3次，辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(按4 000倍稀釋)雜交，室溫孵育2 h，TBST搖床洗膜10 min×3次，暗室中加ECL發(fā)光劑，曝光、顯影、定影，用圖像分析系統(tǒng)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行光密度掃描，用Quantity One圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組大鼠生化指標(biāo)、腎組織IGF-1、MMP-2蛋白表達(dá)的差異，應(yīng)用Pearson積差相關(guān)系數(shù)分析24 h尿蛋白量與IGF-1、MMP-2蛋白表達(dá)量的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠一般狀況及生化指標(biāo)比較見表1。

2.2腎臟病理形態(tài)及免疫組化結(jié)果腎組織PAS染色顯示，與對(duì)照組比較DM組腎小球體積增大，系膜區(qū)基質(zhì)明顯增生，腎小球毛細(xì)血管袢受壓，基底膜增厚，MMF組較DM組有所改善(圖1)。IGF-1、MMP-2免疫組化SP法染色示棕黃色或深棕黃色，在腎小球系膜區(qū)、基底膜及腎小管基底膜均有表達(dá)。IGF-1在DM組表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，MMF組較DM組下降；MMP-2在DM組表達(dá)較對(duì)照組下降，MMF組較DM組增加。見表2、圖2。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)比較

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與DM組比較，P<0.05。

圖1 各組大鼠腎組織病理結(jié)果(PAS，×400)

組別nIGF-1 MMP-2 對(duì)照組12103.28±11.67 167.56±14.04 DM組11165.26±18.65?114.61±14.75?MMF組10136.46±12.47?#137.96±11.29?#F67.96258.442P<0.001<0.001

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與DM組比較，P<0.05。

2.3腎組織中IGF-1、MMP-2蛋白的表達(dá)見表3、圖3。

表3 各組大鼠腎組織中IGF-1、MMP-2蛋白的表達(dá)

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與DM組比較，P<0.05。

圖2 各組大鼠腎組織IGF-1、MMP-2表達(dá)(SP，×400)

圖3 各組大鼠腎組織中IGF-1、MMP-2蛋白的表達(dá)

2.4 24h尿蛋白量與IGF-1、MMP-2蛋白表達(dá)量的相關(guān)性24 h尿蛋白量與IGF-1相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.743，P<0.001)，而與MMP-2相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.756，P<0.001)。IGF-1與MMP-2呈負(fù)相關(guān)(r=-0.582，P<0.001)。

3 討論

流行病學(xué)資料顯示，DM是世界上大多數(shù)國家終末期腎病(ESRD)的最主要原因，但其確切發(fā)病機(jī)制仍不明確，代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)異常、氧化應(yīng)激、炎癥、遺傳背景等多因素均參與其中[7]。因此，如何干預(yù)這些因素和延緩其發(fā)生、進(jìn)展過程是治療DN的關(guān)鍵。目前通過干預(yù)多種細(xì)胞生長因子、減少細(xì)胞外基質(zhì)堆積成為DN治療的新熱點(diǎn)。

該研究中的免疫組化及Western blot檢測均顯示DM組IGF-1表達(dá)增加、MMP-2表達(dá)下調(diào)，推測IGF-1可能通過下調(diào)MMP-2，增加細(xì)胞外基質(zhì)堆積，改變腎臟形態(tài)與功能，從而在DM腎臟損害過程中起作用。IGF-1作為一種細(xì)胞因子，可使大鼠系膜細(xì)胞增生，同時(shí)刺激系膜細(xì)胞合成大量Ⅳ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)[8]。有研究[9]報(bào)道IGF-1在腎臟表達(dá)增加是導(dǎo)致STZ誘導(dǎo)的DM大鼠腎臟肥大和腎小球高濾過的原因之一，與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)的增生除與其合成增加有關(guān)外，還與其降解減少有關(guān)。MMP-2是降解Ⅳ型膠原的主要明膠酶，可以減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。該研究結(jié)果顯示在DM大鼠腎組織IGF-1與MMP-2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，二者與24 h尿蛋白分別呈現(xiàn)正相關(guān)和負(fù)相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了二者在DN進(jìn)展機(jī)制中的作用。

MMF作為一種新型、高效的免疫抑制劑已成功應(yīng)用于腎移植領(lǐng)域，近年來，隨著對(duì)其藥理作用的不斷深入研究，MMF正逐步被應(yīng)用于非移植腎臟疾病。MMF在體內(nèi)代謝為霉酚酸(MPA)，MPA通過抑制次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶，耗竭細(xì)胞內(nèi)的鳥苷酸池，干擾DNA的合成而發(fā)揮藥理作用，可以高效抑制淋巴細(xì)胞增殖、巨噬細(xì)胞活化。國內(nèi)外研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，MMF可以通過抑制炎癥細(xì)胞浸潤對(duì)實(shí)驗(yàn)性DN發(fā)揮保護(hù)作用。MMF對(duì)DM大鼠腎臟IGF-1、MMP-2表達(dá)的影響國內(nèi)外報(bào)道甚少。該研究結(jié)果顯示MMF早期干預(yù)STZ誘導(dǎo)的DM大鼠，可使腎臟IGF-1表達(dá)減少、MMP-2表達(dá)上調(diào)，在病理上可見腎小球肥大、系膜細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)增生情況均較DM組改善。推測MMF通過下調(diào)IGF-1表達(dá)和上調(diào)MMP-2表達(dá)，從而抑制系膜細(xì)胞的增殖和系膜基質(zhì)的沉積。

綜上所述，MMF對(duì)DN的保護(hù)作用可能部分與其減少IGF-1在腎臟的表達(dá)有關(guān)。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，將對(duì)其作用劑量和時(shí)效做進(jìn)一步的分析及不良反應(yīng)評(píng)估，以期為臨床治療DN提供新的思路和證據(jù)。

致謝：感謝趙瑛瑛、張文吉、張宛哲、孟晶茜、申鵬霄等老師在該研究的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)階段給予的支持和幫助，感謝河南省中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)設(shè)施及高水波老師給予的悉心幫助！

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