胃腺癌組織中SLP-2的表達及其對SGC7901細胞增殖能力的影響

張 劍，李建生，吳 敏，趙 曄，張自森

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院消化內科 鄭州450052 2)鄭州大學第五附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052

胃癌是世界上最為常見的惡性腫瘤之一，居男性惡性腫瘤發(fā)病率的第3位，女性惡性腫瘤發(fā)病率的第4位。包括中國在內的東亞地區(qū)是世界上胃癌發(fā)病率和病死率最高的地區(qū)[1]，其病理學類型主要為腺癌。腫瘤的發(fā)生是涉及多基因、多分子水平變化、多階段的一個復雜過程，而癌基因的激活和抑癌基因的失活是該過程的重要事件之一。SLP-2基因是stomatin基因超家族的成員[2]，其具體特性和功能尚未查明。中國醫(yī)學科學院張立勇等[3]首次發(fā)現(xiàn)SLP-2基因在食管鱗狀細胞癌中的表達水平是正常食管黏膜中的6倍以上，并發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。作者采用免疫組化法檢測人胃腺癌組織中SLP-2的表達，并觀察小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默胃腺癌SGC7901細胞株中SLP-2的表達后，SGC7901細胞增殖能力的改變，探討SLP-2在胃腺癌中的表達特點及其與胃腺癌發(fā)生發(fā)展的關系。

1 材料與方法

1.1胃腺癌及配對組織收集鄭州大學第五附屬醫(yī)院2010年5月至2011年4月手術切除胃癌標本45例，取癌組織及癌旁正常組織(距離癌組織邊緣>5 cm)。所有標本均經(jīng)病理學檢查確診為胃腺癌，患者術前未接受過放、化療。其中男27例，女18例；年齡45～78歲，中位年齡63歲。臨床分期按TNM分期標準(AJCC 2010年第7版)。

1.2SLP-2蛋白表達的免疫組化檢測所有組織均用體積分數(shù)10%福爾馬林溶液固定，經(jīng)脫水、包埋、3 μm厚連續(xù)切片。鼠抗人SLP-2單克隆抗體購自美國Proteintech Group公司(按200倍稀釋)。即用型一步法(非生物素)檢測試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。操作步驟按試劑盒說明書進行。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。免疫組化染色由兩位高年資病理科醫(yī)師在雙盲條件下進行評定，判定標準參照文獻[4]，每張切片根據(jù)陽性細胞染色程度及細胞陽性百分數(shù)進行分級。染色程度根據(jù)每張切片的大多數(shù)細胞染色特征決定：細胞膜及細胞質無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。陽性細胞百分數(shù)：無陽性細胞為0分，1%～為1分，26%～為2分，51%～為3分，>75%為4分。兩項評分相乘，總值≥8分為陽性表達，<8分為陰性表達。

1.3SGC7901細胞中SLP-2mRNA表達的檢測

1.3.1 SGC7901細胞的培養(yǎng) 用含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人中分化胃腺癌SGC7901細胞系(購自上海中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)，4～6 d傳代1次，選用對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3.2 SLP-2 mRNA檢測 SLP-2及內參β-actin擴增引物由上海生工生物工程有限公司設計合成。SLP-2上游引物序列5’- CTGGAGCCTGGTTTGAAC AT-3’，下游引物序列5’- AGGATCTGGGCCTGT TTCTT-3’，產(chǎn)物大小為500 bp。β-actin上游引物序列5’- ACACTGTGCCCATCTACGACC-3’，下游引物序列5’-AGGGGCCGGACTCGTCATAGA-3’，產(chǎn)物大小為242 bp。按照TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)說明書提取細胞總RNA。PCR反應體系： 2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，β-actin上、下游引物各1 μL，SLP-2上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。取擴增產(chǎn)物進行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀掃描電泳條帶，以SLP-2與β-actin條帶灰度值的比值表示SLP-2 mRNA的相對表達水平。

1.4siRNA轉染對SGC7901細胞增殖的影響SLP-2 siRNA序列由上海吉瑪公司設計合成，Sense：5’- UGCUGCCUGAUUUAUCUGUUCAGCC-3’，Antisense：5’-GGCUGAACAGAUAAAUCAGGCAGCA-3’。細胞按5×104個/孔接種于24孔板上，參考LipofectamineTM2000 說明書進行轉染。實驗設陰性對照組和空白對照組。轉染后24、48、72和96 h各取1塊24孔板，每孔加入200 μL(5 g/L) MTT，置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。棄MTT，每孔加入200 μL二甲基亞砜(DMSO),酶標儀(Bio-Rad)測定490 nm處的光密度值。

1.5siRNA轉染對SGC7901細胞周期的影響轉染48 h后收集siRNA轉染組、陰性對照組和空白對照組細胞，參考文獻[5]處理后，采用流式細胞儀檢測細胞周期。實驗中每組各設3個平行對照。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0進行分析。應用McNemar檢驗比較2種組織中SLP-2蛋白表達的差異,應用χ2檢驗或校正χ2檢驗比較不同臨床病理特征胃腺癌SLP-2蛋白表達的差異，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗分析轉染SLP-2 siRNA后SGC7901細胞增殖及細胞周期的變化。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1癌旁正常胃黏膜及胃腺癌組織中SLP-2蛋白的表達見圖1及表1。癌旁正常胃黏膜中SLP-2蛋白多呈低表達(圖1A)，而在胃腺癌組織中則多呈高表達(圖1B)。胃腺癌和癌旁正常胃黏膜組織中SLP-2蛋白陽性表達率分別為68.9%(31/45)和26.7%(12/45)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.429，P<0.001)。

表1 正常胃黏膜及胃腺癌組織中SLP-2蛋白的表達 例

2.2SLP-2蛋白表達與胃腺癌臨床病理特征的關系見表2。

圖1 正常胃黏膜(A)及胃腺癌(B)組織中SLP-2蛋白的表達(SP，×100)

臨床病理特征nSLP-2蛋白表達陽性陰性χ2P性別 男272070.8470.357 女18117年齡 ≤50歲10640.091 0.763 >50歲352510腫瘤直徑 ≤5 cm3220121.204 0.273 >5 cm13112分化程度 高-中分化292180.123 0.725 低分化16106淋巴結轉移 有312564.784 0.029 無1468TNM分期 Ⅰ、Ⅱ期11475.318 0.021 Ⅲ、Ⅳ期34277

：校正χ2檢驗。

2.3siRNA轉染有效序列和時間點的確定見圖2。結果顯示，圖2中的序列為有效序列，且轉染后48 h后表達抑制率最高，表達降低幅度最大，因此該時間點被選做轉染有效時間點。

圖2 SLP-2 siRNA轉染48 h后各組SGC7901細胞中SLP-2 mRNA的表達

2.4SLP-2siRNA轉染對SGC7901細胞增殖的影響見表3。SLP-2 siRNA轉染組細胞與空白對照組和陰性對照組相比，增殖活性降低。

表3 3組SGC7901細胞增殖活性檢測結果 (n=3)

△：分別與兩對照組相比，P<0.01。

2.5SLP-2siRNA轉染后細胞周期的變化見表4。

表4 3組SGC7901細胞的細胞周期變化 %

△：分別與兩對照組相比，P<0.01。

3 討論

SLP-2基因是2000年首次發(fā)現(xiàn)并命名的一個新基因，并在當時被鑒定為細胞膜相關蛋白[2]。近年來關于線粒體的蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)，SLP-2存在于細胞的線粒體中[6]，并與一些線粒體內膜相關蛋白直接結合，可能參與調節(jié)與其結合的線粒體膜相關蛋白的穩(wěn)定性[7-8]。

張立勇等[3]首次發(fā)現(xiàn)SLP-2基因在食管鱗狀細胞癌中過表達，并與腫瘤的發(fā)生﹑發(fā)展關系密切。此后的一些研究[9-14]表明，SLP-2基因在肺癌、子宮內膜癌、結直腸癌等惡性腫瘤中也存在高表達。作者的實驗結果顯示胃腺癌組織中SLP-2蛋白表達水平較癌旁正常胃黏膜組織明顯升高，且晚期胃腺癌組織中的表達水平高于較早期癌組織，在有淋巴結轉移的病例中表達水平高于無淋巴結轉移的病例。

作者采用RNA干擾技術沉默SGC7901細胞SLP-2的表達，結果表明，SLP-2基因沉默后，SGC7901細胞增殖活性降低，細胞被阻滯在G1期。

綜上所述，SLP-2基因異常表達在胃腺癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。

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