還原型谷胱甘肽對哮喘豚鼠氣道上皮細胞的保護作用

張鐵栓，張國俊#，劉 穎

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450014

支氣管哮喘(哮喘)是危害人類健康的常見呼吸系統(tǒng)疾病，近年來其發(fā)病率不斷攀升[1-2]。當前對該病的病因及發(fā)病機制尚未完全清楚，研究[3]表明氧化-抗氧化失衡是其發(fā)病機制之一，因此，推測通過提高細胞內(nèi)抗氧化劑含量、減輕肺組織抗氧化損傷能達到治療哮喘的目的。谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)是典型的非蛋白硫醇類物質(zhì)，它在一系列的酶類和非酶類反應(yīng)中發(fā)揮作用，維持組織中的氧化還原平衡。而γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine，γ-GCS)是還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)合成的關(guān)鍵限速酶，它的數(shù)量、活性及底物的濃度決定GSH 合成的速率和量[4]。作者以此為出發(fā)點，通過建立豚鼠哮喘模型，測定肺組織中GSH、γ-GCS及下游炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平，同時與常規(guī)抗炎激素進行比較，觀察GSH對哮喘豚鼠氣道上皮細胞的影響。

1 材料與方法

1.1材料實驗動物：健康豚鼠48只，雌雄各24只，體質(zhì)量(450±25) g，由河南省實驗動物中心提供。主要試劑：雞卵白蛋白購自美國Sigma公司，GSH、γ-GCS和TNF-α檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。儀器：圖像采集(德國Lecia顯微照像系統(tǒng))、分析系統(tǒng)(上海山富科學儀器有限公司，Biosens Digital Imaging System v1.6)。注射用GSH(0.6 g/支)購自重慶藥友制藥有限責任公司。

1.2實驗動物分組、建模48只豚鼠實驗前飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、地塞米松組和GSH組4組，每組各12只動物。參照文獻[5]的方法制備哮喘模型。模型組、地塞米松組和GSH組腹腔注射100 g/L雞卵白蛋白2 mL，對照組腹腔注射生理鹽水2 mL；2周后，對照組霧化吸入生理鹽水，模型組、地塞米松組和GSH組霧化吸入10 g/L的雞卵白蛋白誘使哮喘發(fā)作。在誘發(fā)前，模型組腹腔注射生理鹽水2 mL，地塞米松組和GSH組分別按地塞米松2 mg/(kg·d)和GSH 0.1 g/(kg·d)劑量腹腔注射2 mL配比液，共7 d。

1.3支氣管肺泡灌洗液細胞學檢查、肺組織學觀察及肺組織中GSH、γ-GCS和TNF-α的測定各組豚鼠末次激發(fā)結(jié)束后，用100 mg/kg戊巴比妥麻醉，打開胸腔，暴露心肺，分離出氣管，夾閉左主支氣管，對右肺灌洗3次，收集肺泡灌洗液離心，取上清液進行細胞學檢查。取下右肺制作組織勻漿，離心后取上清液按試劑盒說明測GSH。取下左肺，部分以體積分數(shù)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，做HE染色及特殊染色。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水、抗原修復(fù)及兔血清封閉，加相應(yīng)的γ-GCS和TNF-α抗體，生物素標記兔IgG，經(jīng)SABC 孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后，脫水封片。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0進行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組大鼠支氣管肺泡灌洗液細胞學檢查結(jié)果和肺組織中GSH、γ-GCS及TNF-α表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1支氣管肺泡灌洗液細胞學檢查結(jié)果見表1。

表1 支氣管肺泡灌洗液白細胞分類 104 mL-1

*與模型組比較，P<0.05;△與對照組比較，P<0.05；#與地塞米松組比較，P<0.05。

2.2肺組織學觀察結(jié)果見圖1。對照組肺組織、肺泡、支氣管結(jié)構(gòu)正常，支氣管無炎性細胞浸潤。模型組管腔周圍有大量嗜酸細胞為主的炎性細胞浸潤，支氣管黏膜有上皮脫落現(xiàn)象，部分剝蝕，平滑肌斷裂，基底膜破壞，管腔內(nèi)黏液和細胞團塊堆積。與之相比，GSH組支氣管周圍炎性細胞浸潤相對較輕，上皮細胞較完整，基底膜破壞相對較輕。

2.3肺組織中GSH、γ-GCS和TNF-α測定肺組織中γ-GCS和TNF-α在支氣管壁和支氣管旁均有著色，呈褐色，GSH組γ-GCS和TNF-α陽性區(qū)光密度面積低于模型組，見表2、圖2。

表2 肺組織中GSH、γ-GCS和TNF-α測定 (n=12)

*與模型組比較，P<0.05;△與對照組比較，P<0.05；#與地塞米松組比較，P<0.05。

圖1 肺組織光鏡下病理改變 (HE，×200)

圖2 肺組織中γ-GCS和TNF-α的表達(SP，×200)

3 討論

隨著研究的不斷進展，已有足夠證據(jù)表明哮喘患者存在氧化-抗氧化失衡[6]，因此，維持氧化-抗氧化平衡可能成為治療哮喘的一個新的出發(fā)點[7]。該研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用GSH治療的豚鼠肺部病變明顯減輕，主要體現(xiàn)在兩個方面：第一，肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞和上皮細胞的總數(shù)顯著降低；第二，光鏡下病理表現(xiàn)顯示肺組織、肺泡、支氣管結(jié)構(gòu)等的病理改變顯著減輕。原因可能如下：GSH 是含有巰基的非蛋白三肽，是細胞內(nèi)普遍存在的抗氧化劑，參與關(guān)鍵性細胞功能和代謝，包括抗氧化應(yīng)激和調(diào)控細胞生長、增殖，是許多保護系統(tǒng)的關(guān)鍵所在，在解除病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)二巰鍵形成、滅活ROS、合成DNA前體、維持氣道上皮完整性和使上皮細胞免受煙霧及氧化劑介導的肺損傷中發(fā)揮重要作用。為進一步證實氣道上皮細胞的保護作用是否主要來自于GSH，研究中作者對其合成的主要限速酶——γ-GCS進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSH組豚鼠肺組織γ-GCS的表達較模型組降低，說明γ-GCS消耗和GSH的應(yīng)用是一致的，與國內(nèi)相關(guān)報道[8-9]一致。

同時，在研究中作者又對下游因子TNF-α進行了分析，結(jié)果顯示GSH組支氣管旁TNF-α表達較模型組明顯降低。TNF-α作為一種重要的前炎癥因子，在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[10-12]。它可刺激氣道平滑肌，激活正常T細胞表達和分泌細胞因子、白介素-8和粒單集落刺激因子，增加黏附分子的表達，促進炎性細胞在氣道表面的黏附力，增加血栓素的血管收縮活性和肺毛細血管通透性，使肺血管壓力升高，滲出增多。還可以趨化活性嗜酸性粒細胞、巨噬細胞和中性粒細胞，釋放更多的炎癥介質(zhì)，還可以通過核轉(zhuǎn)移因子AP-1促進與炎癥有關(guān)的細胞因子受體的基因表達，導致更多炎癥因子的釋放，加重組織損傷。

總之，氧化-還原系統(tǒng)失衡是哮喘發(fā)病機制之一，應(yīng)用GSH治療，可以有效地保護哮喘豚鼠氣道上皮細胞，減輕肺組織損傷。該研究結(jié)果為GSH治療哮喘提供了依據(jù)，但是否能推至臨床，尚需進一步的研究。

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