應(yīng)用抑制性消減雜交篩選志賀菌基因轉(zhuǎn)移耐多藥相關(guān)基因*

宋春花，王穎芳，段廣才#，郗園林

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州450001 2)河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室 洛陽(yáng) 471003

近年來(lái)，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用甚至濫用，志賀菌菌株頻繁發(fā)生變異，產(chǎn)生耐藥株，且耐藥率高、耐藥產(chǎn)生速度快及范圍廣[1-2]，給細(xì)菌性痢疾的防治帶來(lái)新的挑戰(zhàn)，因此深入探討志賀菌耐多藥機(jī)制成為目前解決志賀菌耐多藥的先決條件。該實(shí)驗(yàn)采用差異表達(dá)基因克隆技術(shù)抑制性消減雜交[3]，以志賀菌敏感株構(gòu)建的基因轉(zhuǎn)移耐多藥株基因組DNA為檢測(cè)子，敏感株基因組DNA為驅(qū)趕子，進(jìn)行抑制性消減雜交，通過(guò)對(duì)志賀菌敏感株與基因轉(zhuǎn)移耐多藥株基因組進(jìn)行完整對(duì)比，構(gòu)建高效的基因轉(zhuǎn)移耐多藥志賀菌DNA消減雜交文庫(kù)，采用斑點(diǎn)雜交篩選基因轉(zhuǎn)移耐多藥相關(guān)基因，為探討志賀菌耐多藥機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1菌株、主要試劑及儀器敏感株：采用改良K-B紙片法，從臨床分離鑒定的志賀菌株中，篩選1株對(duì)頭孢噻吩、諾氟沙星、慶大霉素、磺胺甲基異惡唑均敏感的福氏志賀菌株；基因轉(zhuǎn)移耐多藥株(轉(zhuǎn)移株)：為作者所在的課題組構(gòu)建，見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小提試劑盒(AXYGEN 公司)，PCR-Select Bacterial Genome Subtraction Kit(CLONTECH公司)，地高辛標(biāo)記試劑盒(ROCHE公司)。Hybond-N+尼龍膜(Amersham 公司)，DNA擴(kuò)增儀為 GeneAmp(r)PCR System 9700(美國(guó)ABI公司)。

1.2抑制性消減雜交文庫(kù)的構(gòu)建①采用細(xì)菌基因組DNA小提試劑盒提取志賀菌敏感株、轉(zhuǎn)移株的全基因組DNA，以志賀菌敏感株基因組DNA為驅(qū)趕子，轉(zhuǎn)移株基因組DNA為檢測(cè)子，檢測(cè)子和驅(qū)趕子的DNA分別用同一種識(shí)別4堿基序列的限制性內(nèi)切酶RsaⅠ酶切獲得平均長(zhǎng)度約600 bp的DNA片段。②將檢測(cè)子DNA均分為2份，分別接上接頭Adaptor 1和Adaptor 2R。接頭外側(cè)序列與第1次PCR引物序列相同，而內(nèi)側(cè)序列則與第2次巢式PCR引物序列相同，有利于后續(xù)PCR的篩選擴(kuò)增。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定連接效率在25%以上。③兩輪消減雜交：用過(guò)量驅(qū)趕子DNA樣品分別與上述2份連有接頭的檢測(cè)子DNA樣品進(jìn)行第1次消減雜交。然后，混合上述2份雜交樣品，同時(shí)加入新的變性驅(qū)趕子DNA進(jìn)行第2次消減雜交。④兩次PCR反應(yīng)：加入根據(jù)接頭設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行兩次PCR。⑤消減效率的檢測(cè)：以經(jīng)消減雜交和未經(jīng)消減雜交的第2輪PCR產(chǎn)物為模板，應(yīng)用23S rRNA 5’和3’引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定兩次PCR產(chǎn)物及消減效率。⑥將基因轉(zhuǎn)移耐多藥抑制性消減雜交產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α高效感受態(tài)細(xì)胞，克隆增殖，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，并將全部陽(yáng)性克隆以體積分?jǐn)?shù)30%的甘油保存，構(gòu)建抑制性消減雜交文庫(kù)。

1.3志賀菌轉(zhuǎn)移耐多藥相關(guān)基因的篩選采用PCR技術(shù)鑒定消減雜交文庫(kù)中的部分陽(yáng)性克隆，用地高辛標(biāo)記試劑盒中DIG-High Prime將待標(biāo)記的DNA探針片段變性后與隨機(jī)引物一起雜交，然后以此雜交的寡核苷酸為引物，在DNA聚合酶Ⅰ大片段的催化下，合成與探針DNA互補(bǔ)的DNA鏈，反應(yīng)液中含有DIG-11-dUTP，即形成地高辛標(biāo)記的DNA探針；分別用RsaⅠ消化的志賀菌敏感株、轉(zhuǎn)移株DNA片段標(biāo)記的探針與基因轉(zhuǎn)移耐多藥消減雜交文庫(kù)中80個(gè)陽(yáng)性克隆巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，篩選基因轉(zhuǎn)移耐多藥相關(guān)基因片段；對(duì)篩選到的耐多藥相關(guān)基因片段用M13雙向引物測(cè)序，各差異片段序列通過(guò)http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進(jìn)行同源性檢索，物種選擇細(xì)菌。

2 結(jié)果

2.1志賀菌轉(zhuǎn)移耐多藥相關(guān)基因消減文庫(kù)的鑒定結(jié)果志賀菌敏感株與轉(zhuǎn)移株抑制性消減雜交基因片段經(jīng)與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化克隆后，共獲得1 080 個(gè)陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑取了192個(gè)陽(yáng)性克隆做菌液PCR鑒定，有181個(gè)克隆含有插入片段，轉(zhuǎn)化率94.3%。采用巢式PCR引物鑒定消減文庫(kù)中隨機(jī)挑取的陽(yáng)性克隆的插入片段，結(jié)果所有片段長(zhǎng)度均在1 000 bp左右(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 消減雜交文庫(kù)部分陽(yáng)性克隆的PCR鑒定

2.2探針濃度測(cè)定結(jié)果隨機(jī)引物法標(biāo)記RsaⅠ消化的志賀菌敏感株、轉(zhuǎn)移株基因組DNA片段，經(jīng)地高辛核酸檢測(cè)程序，顯色結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照DNA的顏色對(duì)比，根據(jù)稀釋倍數(shù)推算出標(biāo)記探針的濃度。志賀菌敏感株和轉(zhuǎn)移株基因組酶切片段探針的質(zhì)量濃度約為780和500 mg/L。

2.3基因轉(zhuǎn)移耐多藥陽(yáng)性克隆的篩選經(jīng)過(guò)對(duì)斑點(diǎn)雜交信號(hào)的對(duì)比(圖2)，初步獲得5個(gè)差異基因片段(在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)雜交信號(hào)相差5倍)，其中4個(gè)基因片段表現(xiàn)為與轉(zhuǎn)移株DNA片段標(biāo)記的探針雜交信號(hào)增強(qiáng)，其相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性克隆編號(hào)分別為T2A11、T2F8、T2G7、T1F11；另1個(gè)則與敏感株DNA片段標(biāo)記的探針雜交信號(hào)增強(qiáng)，其相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性克隆編號(hào)為T2F5。

2.4基因轉(zhuǎn)移耐多藥差異片段序列檢索結(jié)果基因轉(zhuǎn)移耐多藥差異片段經(jīng)克隆測(cè)序后，在BLAST上進(jìn)行同源序列檢索，結(jié)果該5個(gè)差異片段有3個(gè)未檢索到同源序列，2個(gè)與已知基因有同源性，分別為80.0%和50.1%，見(jiàn)表1。

表1 基因轉(zhuǎn)移耐多藥相關(guān)基因片段序列檢索結(jié)果

圖2 基因轉(zhuǎn)移耐多藥消減雜交文庫(kù)的差異篩選(斑點(diǎn)雜交)

A：與標(biāo)記的轉(zhuǎn)移株基因組DNA探針雜交結(jié)果；B：與標(biāo)記的敏感株基因組DNA探針雜交結(jié)果。

3 討論

3.1基因轉(zhuǎn)移耐多藥志賀菌DNA抑制性消減雜交文庫(kù)的構(gòu)建研究細(xì)菌基因組的差異，構(gòu)建DNA消減文庫(kù)是最有效的方法[3]。近幾年，也有學(xué)者把它應(yīng)用于耐藥相關(guān)基因的篩選。季明春等[5]應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建耐藥性淋球菌與標(biāo)準(zhǔn)參考菌株差異DNA消減文庫(kù)，證明5個(gè)片段均為未知新序列，可能為新的耐藥相關(guān)基因。朱寧希等[6]用抑制性消減雜交發(fā)現(xiàn)了11個(gè)白血病多藥耐藥相關(guān)基因，包括S3核糖體蛋白基因、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞單位2基因及My023基因等，其中多數(shù)基因與腫瘤多藥耐藥的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道，提示了白血病多藥耐藥的發(fā)生可能存在新的機(jī)制。

構(gòu)建高質(zhì)量的抑制性消減雜交文庫(kù)是耐多藥相關(guān)基因研究的關(guān)鍵一步，而消減效率是抑制性消減雜交文庫(kù)能否構(gòu)建成功的關(guān)鍵。經(jīng)兩次消減雜交及兩輪抑制性PCR后，檢測(cè)子與驅(qū)趕子中相同的片段絕大部分被消減掉，而那些差異基因片段應(yīng)該被富集。該實(shí)驗(yàn)的消減效率分析表明，消減后的轉(zhuǎn)移株DNA均在28個(gè)循環(huán)之后才看到23S rRNA產(chǎn)物，而未消減的轉(zhuǎn)移株DNA可在18個(gè)循環(huán)后就看到23S rRNA產(chǎn)物，說(shuō)明消減效率較高。此外，該研究將志賀菌敏感株與轉(zhuǎn)移株抑制性消減雜交基因片段與高效的克隆PCR產(chǎn)物專用載體pMD18-T連接、轉(zhuǎn)化克隆后，有效轉(zhuǎn)化率為94.3%，說(shuō)明所構(gòu)建的消減文庫(kù)質(zhì)量好，特異度高，篩選的意義較大。

3.2基因轉(zhuǎn)移耐多藥相關(guān)基因作者所獲基因轉(zhuǎn)移耐多藥差異片段經(jīng)測(cè)序后，在BLAST上檢索同源序列，結(jié)果該5個(gè)差異片段有2個(gè)與已知基因有較好的同源性，分別為Tn3926轉(zhuǎn)座子部分的轉(zhuǎn)座酶基因和23S rRNA核糖體核糖核酸；3個(gè)未檢索到同源序列，為未知序列，可能為新的基因轉(zhuǎn)移耐多藥相關(guān)基因。

3.2.1Tn3926轉(zhuǎn)座酶基因Lett等[7]于1985年首次從小腸耶爾森菌中分離出一種編碼汞抗性基因的轉(zhuǎn)座子Tn3926，并發(fā)現(xiàn)其編碼的轉(zhuǎn)座酶調(diào)節(jié)Tn21的轉(zhuǎn)座；1989年Turner等[8]克隆了Tn3926全長(zhǎng)序列，發(fā)現(xiàn)其序列與Tn21同源性為80.0%。Lai等[9]應(yīng)用抑制性消減雜交比較肺炎克雷伯桿菌產(chǎn)毒株與不產(chǎn)毒株基因組的差異，通過(guò)斑點(diǎn)雜交發(fā)現(xiàn)19個(gè)片段與肺炎克雷伯桿菌產(chǎn)毒相關(guān)，其中有2個(gè)片段編碼Tn3926轉(zhuǎn)座酶基因，說(shuō)明轉(zhuǎn)座子參與了肺炎克雷伯桿菌的產(chǎn)毒。該研究篩選出的基因轉(zhuǎn)移耐多藥相關(guān)基因片段T2F8與Tn3926轉(zhuǎn)座酶基因同源，而轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶又誘導(dǎo)插入序列的轉(zhuǎn)座，提示轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的耐藥模式在志賀菌基因轉(zhuǎn)移耐多藥機(jī)制中存在，推測(cè)其在抗性基因的水平轉(zhuǎn)移中起一定作用。

3.2.2 23SrRNA核糖體核糖核酸細(xì)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制是該類抗菌藥物的作用靶位發(fā)生改變。最早報(bào)道大腸桿菌對(duì)紅霉素產(chǎn)生耐藥的原因是23S rRNA上第2 058位的腺嘌呤被甲基化，這種甲基化是由一種質(zhì)粒介導(dǎo)的甲基化酶的產(chǎn)生所致，這種甲基化酶能夠使23S rRNA上的一個(gè)關(guān)鍵性的腺嘌呤殘基甲基化，從而可能引起核糖體構(gòu)型變化，阻礙紅霉素與SOS核糖體亞基的結(jié)合，使進(jìn)入胞內(nèi)的抗生素不能與之結(jié)合而失去作用[10-11]。另外，對(duì)臨床分離得到的耐紅霉素肺炎支原體的研究也發(fā)現(xiàn)這種耐藥性的產(chǎn)生[12]。1997年Versalovic等[13-14]報(bào)道了克拉霉素耐藥性的產(chǎn)生與H.pylori23S rRNA基因的點(diǎn)突變有關(guān)，導(dǎo)致核糖體的構(gòu)象改變，使大環(huán)內(nèi)酯類抗生素結(jié)合位點(diǎn)也隨之發(fā)生改變，進(jìn)而使H.pylori與大環(huán)內(nèi)酯類藥物親和能力減弱，藥物不能阻止細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成，最終產(chǎn)生耐藥性。

該研究對(duì)差異片段T1F11測(cè)序并檢索發(fā)現(xiàn)其與23S rRNA基因同源性為50.1%，結(jié)合消減雜交中使用的檢測(cè)子為已構(gòu)建的志賀菌基因轉(zhuǎn)移耐多藥菌株[4]，在構(gòu)建過(guò)程中所使用的4類抗生素中并無(wú)大環(huán)內(nèi)酯類藥物，說(shuō)明23S rRNA所介導(dǎo)的細(xì)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物耐藥的機(jī)制在志賀菌基因轉(zhuǎn)移耐多藥機(jī)制中存在。

另外，研究中新發(fā)現(xiàn)了3個(gè)耐多藥相關(guān)基因片段，可能為耐多藥的新機(jī)制。雖然該研究?jī)H對(duì)部分差異片段進(jìn)行分析，但初步研究結(jié)果說(shuō)明志賀菌耐多藥是多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，后續(xù)研究將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的耐多藥相關(guān)基因，最終將全面闡明志賀菌的耐多藥機(jī)制。

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