慢病毒介導(dǎo)fgl2基因沉默對心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞Ang-1、Ang-2 mRNA表達(dá)及細(xì)胞增殖、遷移的影響*

鄭振中，王 亮，吳友平，殷 然，王夢洪，鄭澤琪，彭景添，魏云鋒

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 南昌 330006

纖維介素2(fibrinogen-like protein 2,fgl2)屬于纖維蛋白家族中的一員，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，可由活化的巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌、合成，國內(nèi)外有關(guān)fgl2的研究[1-3]主要集中在肝病方面，提示其可能參與血管新生等病理生理過程，但目前缺乏關(guān)鍵環(huán)節(jié)的直接證據(jù)來證明fgl2與心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(myocardial microvascular endothelial cells，MMVECs)增殖、遷移等血管形成因素的關(guān)系。促血管生成素(angiopoietins，Ang)在血管新生過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，但Ang是否介導(dǎo)fgl2調(diào)控的心肌MMVECs的血管新生作用尚不明確。作者通過制作并包裝人fgl2的RNA干擾慢病毒，轉(zhuǎn)染MMVECs，觀察了fgl2基因沉默對MMVECs中fgl2、Ang-1和Ang-2 mRNA表達(dá)的影響及對MMVECs增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑HEK293T細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所；重組病毒質(zhì)粒及輔助包裝原件載體質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學(xué)公司；LipofectamineTM2000、Trizol試劑盒購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄RNA試劑盒購自Promega公司；RNase-free購自Axygen公司；小鼠抗人fgl2抗體購自美國Sigma公司，山羊抗小鼠IgG 抗體、小鼠抗人GAPDH 抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2慢病毒載體的構(gòu)建及病毒包裝從GenBank中查找大鼠fgl2基因，按RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)4組針對fgl2基因cds區(qū)的靶序列。DNA片段由上海吉凱基因化學(xué)公司合成。設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸片段稀釋后在退火反應(yīng)體系中形成雙鏈DNA片段，經(jīng)T4 DNA連接酶插入到經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的線性質(zhì)粒pGCSIL-GFP中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，搖菌后接種到LB瓊脂培養(yǎng)基，篩選陽性克隆行PCR及測序鑒定。fgl2上游引物序列5’-AGTCGCTCCAACTGGTAAAT-3’，下游引物序列5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min；4 ℃保存。Western Blot檢測外源篩選有效靶點(diǎn)的干擾效果，確認(rèn)有效靶點(diǎn)并進(jìn)行病毒包裝，得fgl2-RNAi-LV。系列稀釋法測定病毒滴度為1×109TU/mL。

1.3MMVECs的培養(yǎng)、鑒定及分組取7 d齡大鼠乳鼠心臟，剪去主動脈、左右心房、右心室，保留左心室，用PBS洗凈血液。小心剝離心外膜及心內(nèi)膜。用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇滅活30 s，PBS沖洗干凈，剪碎，加入適量的0.8 g/L胰蛋白酶，37 ℃水浴消化3次。適量1 g/LⅡ型膠原酶(用不含血清DMEM稀釋)消化組織，置于37 ℃孵箱中消化3 h。轉(zhuǎn)移至超凈臺中，加含體積分?jǐn)?shù)20%血清的培養(yǎng)基終止消化。1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸沉淀。反復(fù)離心3次。離心所得的細(xì)胞用200目篩網(wǎng)過濾，過濾后所得細(xì)胞懸于含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，接種于2 g/L明膠預(yù)處理的培養(yǎng)瓶中37 ℃培養(yǎng)。每隔2 d換液一次，直至長成細(xì)胞單層。1.25 g/L胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，傳代至爬片上，孵箱過夜，待細(xì)胞貼壁長滿后，取出爬片，固定后采用免疫熒光方法檢測MMVECs特異性標(biāo)志CD31-RA、Ⅷ-RA。經(jīng)鑒定過的細(xì)胞培養(yǎng)96 h后收集，分為以下3組：單純MMVECs組(對照組)、攜帶GFP空載體的慢病毒轉(zhuǎn)染MMVECs組(GFP組)和fgl2-RNAi-LV轉(zhuǎn)染組。取第3代細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 d將MMVECs以適當(dāng)密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞達(dá)60%～70%融合時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h 將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，慢病毒轉(zhuǎn)染6～8 h后，更換體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清培養(yǎng)基。24～72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)。

1.4各組MMVECs中fgl2、Ang-1和Ang-2mRNA的檢測嚴(yán)格按照Trizol試劑說明書進(jìn)行。取少許RNA樣本稀釋100倍后，以核酸蛋白分析儀測定D(260 nm)、D(280 nm)及D(260 nm)/D(280 nm)值，判定RNA的純度和濃度，-70 ℃保存?zhèn)溆?。采用熒光定量RT-PCR測定 mRNA。根據(jù)GenBank中相應(yīng) cDNA 序列設(shè)計(jì)引物。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min；94 ℃變性 10 s，58/55/60 ℃退火20 s，72 ℃延伸 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.5各組MMVECs增殖能力的MTT法檢測用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔104個(gè)細(xì)胞接種到 96孔板，每孔體積 200 μL(每組設(shè)8個(gè)孔，2個(gè)對照孔)，按照一般內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)4 d。分別在培養(yǎng)第2、3、4天每孔加5 g/L MTT 溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加100 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇 490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔吸光值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6細(xì)胞遷移能力的Transwell檢測將直徑為8.0 μm的Transwell小室放入培養(yǎng)板中。消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105mL-1，取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室的上室。在下室加入500 μL含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h。用棉簽輕輕擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下，取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿透細(xì)胞平均數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 14.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)分析各組MMVECs fgl2、Ang-1和Ang-2 mRNA的表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞遷移能力的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

3組MMVECs fgl2、Ang-1和Ang-2 mRNA的表達(dá)及細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞遷移能力的比較見表2。與對照組和GFP組比較，fgl2-RNAi-LV轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中fgl2 mRNA表達(dá)下調(diào)，Ang1、Ang2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)肌增殖能力、遷移能力增強(qiáng)，而對照組與GFP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組細(xì)胞Fgl2、Ang-1和Ang-2 mRNA的表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力、遷移能力的比較

*與對照組和GFP組比較，P<0.05。

3 討論

Ang是繼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)之后發(fā)現(xiàn)的又一類內(nèi)皮細(xì)胞特異性促血管新生因子，這類細(xì)胞因子與酪氨酸激酶樣受體(Tie-2受體)結(jié)合后構(gòu)成Ang/Tie-2信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在血管生成的過程中發(fā)揮非常重要的調(diào)節(jié)作用[4]。Ang-1與其特異性受體Tie2結(jié)合，誘導(dǎo)Tie2酪氨酸激酶磷酸化，引起磷脂酰肌醇-3-激酶p85亞單位磷酸化并激活[5-6]，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化、聚集，吸引周細(xì)胞包圍，生成新生血管以及調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)血管成熟，維持血管的穩(wěn)定性和完整性[7]。Ang-2與Ang-1有60%的同源性氨基酸，也能特異性識別Tie2受體。然而多數(shù)學(xué)者[8]認(rèn)為Ang-2為無信號傳導(dǎo)功能的Tie2配體，不引起Tie2受體的磷酸化，可以競爭性地阻斷Ang-1的效應(yīng)，有促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)移行的作用，Ang-2與EPCs間的相互作用可能是新生血管形成的始動環(huán)節(jié)。Ang-2與EPCs間的相互作用，使由EPCs分化而來的內(nèi)皮細(xì)胞增加，也可以提高心肌內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目。在VEGF等生長因子存在的條件下，Ang-2可以加強(qiáng)VEGF 的促血管生成作用，誘導(dǎo)血管出芽和重建；而在沒有VEGF 等生長因子存在的條件下，因其阻斷Ang-1穩(wěn)定血管的作用，使血管退化，血管數(shù)目減少，同時(shí)伴有內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[9-11]。

作者通過構(gòu)建fgl2 RNAi慢病毒，并轉(zhuǎn)染MMVECs，發(fā)現(xiàn)fgl2基因沉默能夠促進(jìn)MMVECs的增殖和遷移，提示fgl2參與了MMVECs對血管新生的調(diào)控，其機(jī)制可能與fgl2上調(diào)Ang-1、Ang-2，從而有效上調(diào)心肌MMVECs的血管新生能力有關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移是血管新生的重要環(huán)節(jié)，該實(shí)驗(yàn)為fgl2基因沉默治療血管新生障礙性疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

總之，該研究明確了fgl2參與調(diào)控MMVECs增殖、遷移等血管新生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為進(jìn)一步研究fgl2在血管新生中的調(diào)控奠定基礎(chǔ)，但fgl2調(diào)控Ang-1及Ang-2表達(dá)的詳細(xì)機(jī)制則需進(jìn)一步闡明。

[1]Su K，Chen F，Yan WM，et al.Fibrinogen-like protein 2/fibroleukin prothrombinase contributes to tumor hypercoagulability via IL-2 and IFN-gamma[J].World J Gastroenterol，2008，14(39)：5980

[2]Cascone T，Heymach JV.Targeting the angiopoietin/Tie2 pathway：cutting tumor vessels with a double-edged sword?[J].J Clin Oncol，2012，30(4)：441

[3]Thomas M，Augustin HG.The role of the angiopoietins in vascular morphogenesis[J].Angiogenesis，2009，12(2)：125

[4]Chen JX，Zeng H，Reese J，et al.Overexpression of angiopoietin-2 impairs myocardial angiogenesis and exacerbates cardiac fibrosis in the diabetic db/db mouse model[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，302(4)：H1003

[5]Kim I，Kim HG，So JN，et al.Angiopoietin-1 regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3’-Kinase/Akt signal transduction pathway[J].Circ Res，2000,86(1)：24

[6]Yuan HT，Khankin EV，Karumanchi SA，et al.Angiopoietin 2 is a partial agonist/antagonist of Tie2 signaling in the endothelium[J].Mol Cell Biol，2009，29(8)：2011

[7]Khan AA，Paul A，Abbasi S，et al.Mitotic and antiapoptotic effects of nanoparticles coencapsulating human VEGF and human angiopoietin-1 on vascular endothelial cells[J].Int J Nanomedicine，2011，6：1069

[8]Ruifrok WP，de Boer RA，Iwakura A，et al.Estradiol-induced，endothelial progenitor cell-mediated neovascularization in male mice with hind-limb ischemia[J].Vasc Med，2009，14(1)：29

[9]Lewis CE，De Palma M，Naldini L.Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis：regulation by hypoxia and angiopoietin-2[J].Cancer Res，2007，67(18)：8429

[10]Figueiredo A，Cordeiro AL，Tomada N，et al.Real-time PCR study of Ang1，Ang2，Tie-2，VEGF，and KDR expression in human erectile tissue during aging[J].J Sex Med，2011，8(5)：1341

[11]蘇建華，林偉，陳玉芳，等.丁咯地爾對大鼠坐骨神經(jīng)嵌壓傷后背根神經(jīng)元凋亡及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，46(5)：674