杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體pUC-chlN 1622-CAT的構(gòu)建*

張匯征，崔柳青，潘衛(wèi)東#，薛樂勛

1)鄭州大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 鄭州 450001 2)河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州 450001

杜氏鹽藻是單細(xì)胞雙鞭毛的真核綠藻，行光合自養(yǎng)，其僅含有的一個(gè)大型杯狀葉綠體占自身體積的50%，適合于葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立。外源基因轉(zhuǎn)入葉綠體基因組是通過同源重組的機(jī)制定點(diǎn)整合完成的，雙交換形式葉綠體同源重組載體的構(gòu)建是關(guān)鍵。該研究的同源片段是以chlN基因及其上下游序列構(gòu)建于外源基因的兩側(cè)，目的在于：轉(zhuǎn)入鹽藻葉綠體后的載體，可以同源重組定點(diǎn)整合的方式插入到葉綠體基因組，確保外源基因插入后可穩(wěn)定遺傳。其中的chlN基因，可與chlB、chlL基因一起共同編碼光非依賴性的原葉綠素酸酯還原酶，該酶廣泛存在于以葉綠素為光合色素的生物中，并主要參與了黑暗條件下葉綠素的合成，破壞任一個(gè)基因(chlN、chlB、chlL基因)都會(huì)阻斷黑暗條件下葉綠素的合成。但是鹽藻可通過光依賴性的原葉綠素酸酯還原酶在光照條件下進(jìn)行葉綠素的合成，使得藻株的正常生長(zhǎng)不受影響。實(shí)驗(yàn)選擇來自原核生物的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)基因和已被證實(shí)在鹽藻葉綠體內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄活性的衣藻葉綠體啟動(dòng)子aptA和終止子rbcL為調(diào)控序列，構(gòu)建理論上較理想的杜氏鹽藻葉綠體雙交換轉(zhuǎn)化載體pUC-chlN 1622-CAT，使它在具有原核性質(zhì)的鹽藻葉綠體系統(tǒng)中能夠順利表達(dá)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株、載體和藻株 大腸桿菌DH5α為鄭州大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究室保存，含CAT表達(dá)盒(以aptA為啟動(dòng)子、rbcL為終止子)的載體pSP71-aptA-CAT由該室構(gòu)建。野生型杜氏鹽藻CCAP19/18購(gòu)于CCAP(Culture Collection of Algae and Protozoa)公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA聚合酶、pMD18-T載體等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，凝膠回收試劑盒購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司，氯霉素購(gòu)自上海生物工程有限公司，PCR mixture、ddH2O購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司。PCR儀，Biometra公司；HPG400型光照培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；電穿孔儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及電擊緩沖液 鹽藻液體培養(yǎng)基配方如下[1]：1.5 mol/L NaCl，12 mmol/L KNO3，0.4 mmol/L KH2PO4，5 mmol/L MgSO4，185 μmol/L H3BO3，0.2 mmol/L CaCl2，2 μmol/L FeCl3，7 μmol/L MnCl2，1 μmol/L ZnCl2，1 μmol/L CoCl2，1 μmol/L CuCl2，1 μmol/L(NH4)6Mo7O24，5 μmol/L Na2EDTA。0.11 MPa滅菌20 min，冷卻后用過濾除菌的1 mol/L NaHCO3調(diào)pH值至8.0。鹽藻固體平板培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基中加入10 g/L瓊脂。

2×HEPES電擊緩沖液(100 mL)[2]：0.04 mol/L HEPES 0.953 2 g，1 mol/L NaCl 5.844 g，0.01 mol/L KCl 0.074 55 g，0.01 mol/L CaCl20.110 99 g，0.4 mol/L山梨醇 7.28 g，0.4 mol/L甘露醇 7.28 g，甘油 3.65 mL。用NaOH調(diào)pH值為7.2，過濾除菌，放4 ℃冰箱備用。

1.1.4 接頭和引物 引物用Primer Premier 5.0輔助設(shè)計(jì)，接頭引物及PCR引物的合成和測(cè)序均由北京六合華大基因科技股份有限公司完成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2pUC-chlN1622-CAT的構(gòu)建鹽藻CCAP19/18以(5～6)×105mL-1的密度接種于新鮮鹽藻液體培養(yǎng)基內(nèi)，明暗周期12 h12 h，26 ℃ 4 500 Lux光照培養(yǎng)7 d后，將500 mL的藻液采用優(yōu)化的SDS-蛋白酶K-酚/氯仿/異戊醇方案抽提得到葉綠體DNA[3]。

以葉綠體DNA作為模板，采用引物1和2擴(kuò)增chlN基因3’端編碼區(qū)及其下游非編碼區(qū)序列。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸7 min，4 ℃停止反應(yīng)。擴(kuò)增獲得DNA片段chlN 1-1622，凝膠電泳檢驗(yàn)并回收。

以chlN 1-1622為模板，采用引物3和4擴(kuò)增得到片段chlN 1-809，采用引物5和6擴(kuò)增得到片段chlN 815-1622。采用酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ對(duì)質(zhì)粒pUC18與chlN 1-809進(jìn)行雙酶切。雙酶切體系：chlN 1-809或質(zhì)粒pUC18 4 μL；EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ各1.5 μL；10×buffer；用ddH2O補(bǔ)足50 μL。37 ℃水浴3 h，分別加入5 μL 10×Loading buffer終止反應(yīng)。電泳回收后進(jìn)行連接。反應(yīng)體系：pUC18(EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切回收)片段1.5 μL；chlN 1-809 (EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切回收)片段3 μL；T4連接酶1 μL；用ddH2O補(bǔ)足10 μL。16 ℃水浴，連接12 h以上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，回收得到載體質(zhì)粒pUC-chlN 809。

用SalⅠ和Hind Ⅲ雙酶切質(zhì)粒pUC-chlN 809和片段chlN 815-1622，電泳回收，將回收后2個(gè)片段過夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，回收得到載體質(zhì)粒pUC-chlN 809-808。

接頭的制備：采用無菌蒸餾水配制濃度為50 μmol/L的接頭引物1及2，各取5 μL加入90 μL無菌蒸餾水中混勻，95 ℃水浴5 min，取出后靜置，自然冷卻至室溫，引物退火形成接頭，接頭依次為BamH Ⅰ-EcoR V-SacⅠ-SmaⅠ-KpnⅠ-SalⅠ黏端。

用EcoRⅤ和SacⅠ雙酶切質(zhì)粒pUC-chlN 809-808和接頭片段，電泳回收后過夜連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，回收得到載體質(zhì)粒pUC-chlN 1622。EcoR Ⅴ和SacⅠ雙酶切pSP71-aptA-CAT載體，將目的片段CAT基因表達(dá)盒回收，載體pUC 1-1622用EcoRⅤ和SacⅠ雙酶切，回收pUC-chlN 1622片段，將目的片段CAT基因與回收的pUC-chlN 1622片段連接，最后得到載體pUC-chlN 1622-CAT。

1.3鹽藻的電擊轉(zhuǎn)化鹽藻按1.2培養(yǎng)7 d后，取1 mL鹽藻培養(yǎng)液，室溫 2 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基清洗1次，加入2×HEPES電擊緩沖液重懸細(xì)胞使其密度達(dá)到(1.0～1.1)×106mL-1，取400 μL混合液加入預(yù)冷的電擊杯內(nèi)，加入終濃度為10 mg/L的目的質(zhì)粒，混勻后冰浴 10 min；設(shè)定電擊參數(shù)25 μF、0.8 kV；電擊后冰浴5 min，最后 4 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，1 mL新鮮培養(yǎng)基重懸并在暗處?kù)o置24 h恢復(fù)培養(yǎng)。如上對(duì)3管進(jìn)行同樣操作，并對(duì)另外3管對(duì)照組進(jìn)行相同的電擊轉(zhuǎn)化(不加質(zhì)粒DNA)。對(duì)轉(zhuǎn)化后的每管轉(zhuǎn)化藻液先加氯霉素至100 mg/L，3 000 Lux光照進(jìn)行過渡培養(yǎng)，1～2 d后加氯霉素至終濃度為300 mg/L，4 500 Lux光照進(jìn)行20 d篩選培養(yǎng)，觀察鹽藻生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1葉綠體轉(zhuǎn)化載體pUC-chlN1622-CAT的鑒定載體pUC-chlN 1622含chlN基因5’端區(qū)域及其上游序列，長(zhǎng)809 bp，含chlN基因3’端編碼區(qū)808 bp，加上接頭30 bp，共長(zhǎng)1 647 bp。酶切鑒定結(jié)果見圖1。

圖1 pUC-chlN 1622-CAT酶切結(jié)果

M：Marker；1：pSP71-atpA-CAT單酶切；2：pSP71-atpA-CAT雙酶切；3：pUC-chlN 1622-CAT單酶切；4：pUC-chlN 1622-CAT雙酶切；5：pUC-chlN 1622單酶切。

2.2鹽藻葉綠體的轉(zhuǎn)化和初步篩選野生藻與轉(zhuǎn)化藻電擊后的生長(zhǎng)情況見圖2。在氯霉素濃度補(bǔ)至300 mg/L以后，野生藻與轉(zhuǎn)化藻在電擊后的前10 d左右，生長(zhǎng)均受到抑制，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。但在10 d后野生藻逐漸白化并全部死亡，而轉(zhuǎn)化藻則繼續(xù)生長(zhǎng)，表現(xiàn)出氯霉素抗性。

2.3轉(zhuǎn)化藻葉綠體基因中CAT基因的PCR鑒定PCR結(jié)果表明順利擴(kuò)增出長(zhǎng)約1 800 bp的CAT基因，見圖3。

圖2 野生藻與轉(zhuǎn)化藻電擊后的生長(zhǎng)情況

圖3 CAT基因的PCR鑒定結(jié)果

3 討論

近年來葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)逐步發(fā)展完善，葉綠體系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)的加工修飾除不能糖基化，其他修飾均能在葉綠體系統(tǒng)正常進(jìn)行，并且葉綠體系統(tǒng)還具有能夠正確折疊和組裝復(fù)雜蛋白的功能，使其產(chǎn)生活性。這一特點(diǎn)無疑讓葉綠體系統(tǒng)在與原核系統(tǒng)相比更似真核系統(tǒng)。利用藻類葉綠體表達(dá)系統(tǒng)作為新型生物反應(yīng)器生產(chǎn)活性蛋白具有良好的前景[4]。因葉綠體表達(dá)系統(tǒng)插入位點(diǎn)可控，基因沉默、基因失活等現(xiàn)象較少發(fā)生，人們開始大量嘗試在高等植物體和藻類的葉綠體中轉(zhuǎn)化表達(dá)外源性基因。其插入位點(diǎn)雖人為可控，但也只是局限于部分可操作區(qū)域，導(dǎo)致了葉綠體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化重組率較核基因組低。因此，在設(shè)計(jì)構(gòu)建同源載體時(shí)，同源片段的選擇尤為重要。

選擇同源片段應(yīng)考慮以下幾個(gè)因素：①藻類葉綠體基因已知，這對(duì)同源片段的獲得和確定起決定性作用。②同源臂長(zhǎng)度適當(dāng)。同源片段過短同源重組發(fā)生率低，片段過長(zhǎng)則操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)入難度加大。李軼女等[5]曾在高等植物的轉(zhuǎn)化中采用的同源臂兩端的長(zhǎng)度在1 000～2 000 bp，結(jié)果證明了這樣的長(zhǎng)度對(duì)轉(zhuǎn)化起著較好的作用，而在衣藻中500 bp也能成功轉(zhuǎn)錄。③同源片段兩端的內(nèi)切酶盡量不同，且具有單一性，目的是方便在進(jìn)行該片段的克隆時(shí)，酶切后均能保持該目的片段的完整性?？赏ㄟ^序列查找或PCR法引入單一的限制性酶切位點(diǎn)。④插入同源片段中間的位點(diǎn)應(yīng)合適，保證外源基因插入并隨之整合到葉綠體基因組后，不會(huì)影響葉綠體及宿主本身的生存活動(dòng)，這是最基本的要求。⑤選擇克隆的片段與原葉綠體基因組應(yīng)具有較好的同源性，這樣不僅能使外源目的基因整合入宿主葉綠體基因相對(duì)較容易，而且在發(fā)生整合以后，除重組段外葉綠體其他基因組序列不會(huì)發(fā)生變化。

作者以已經(jīng)獲得全長(zhǎng)269 044 bp的葉綠體基因組全序列[6](GenBank號(hào)：GQ250046.1)的杜氏鹽藻CCAP19/18[7-10]為研究藻種，克服了絕大多數(shù)物質(zhì)因葉綠體序列資料缺乏而使轉(zhuǎn)化難以實(shí)施的情況。選取chlN基因作為同源片段，將外源基因插入其內(nèi)。chlN基因與chlB、chlL一起編碼光非依賴的原葉綠素酸酯還原酶，任一破壞均可阻斷葉綠素在黑暗條件的合成，但藻類可通過光依賴的原葉綠素酸酯還原酶合成葉綠素，不影響其生存。在同源片段長(zhǎng)度的選擇上，作者采用兩端同源片段均800 bp以上，足夠其實(shí)現(xiàn)同源重組及轉(zhuǎn)化。葉綠體基因組的同質(zhì)化程度同樣也是制約轉(zhuǎn)化的主要原因。所謂同質(zhì)化就是在外源基因轉(zhuǎn)入后，葉綠體自身的基因組中與同源載體同源的片段不斷地被載體中的同源片段所替代，而轉(zhuǎn)化子的抗性也隨之不斷提高。若采用的選擇壓力既能夠讓同質(zhì)化過程順利進(jìn)行，又能在轉(zhuǎn)化藻抗性顯現(xiàn)時(shí)將未轉(zhuǎn)化的藻株全部殺死，那么就能順利地選擇分離得到所需的含目的基因的藻株。作者選擇氯霉素用于篩選，其篩選周期在10 d左右，給同質(zhì)化過程提供了時(shí)間，并在10 d后可逐漸觀察到未轉(zhuǎn)化的藻株漸漸白化并死亡。

作者以鹽藻葉綠體作為生物反應(yīng)器，構(gòu)建轉(zhuǎn)化篩選載體pUC-chlN 1622-CAT，電擊法轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞，在氯霉素抗性選擇壓力下，對(duì)轉(zhuǎn)化的鹽藻細(xì)胞進(jìn)行篩選，并檢測(cè)CAT基因的表達(dá)情況，確定了以chlN基因?yàn)橥雌螛?gòu)建鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體的初步可行性。該研究為在鹽藻葉綠體內(nèi)高效表達(dá)外源性蛋白提供了先決條件。

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