產(chǎn)胸苷磷酸化酶短乳桿菌融合菌株的構(gòu)建及其特性*

王偉潔，李紅梅，薛芳，高露嬌，黃艷青

1(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)

2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海，200090)

核苷磷酸化酶分3類(lèi):嘌呤核苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶［1］，其中胸苷磷酸化酶主要用來(lái)合成核苷類(lèi)藥物，在“補(bǔ)救途徑”中催化脫氧胸苷可逆磷酸化反應(yīng)，提供2-脫氧核糖-1-磷酸，釋放堿基胸腺嘧啶，加入另一種堿基生成新的核苷，在腫瘤治療中有著重要的作用［2－3］。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的核苷磷酸化酶的產(chǎn)生菌主要有大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、乙酰短桿菌以及歐文桿菌等［4］，短乳桿菌產(chǎn)核苷磷酸化酶卻鮮有報(bào)道。

目前酶法合成核苷類(lèi)物質(zhì)的酶多數(shù)來(lái)源于野生菌株，基因工程菌盡管能有效提高酶產(chǎn)量，但構(gòu)建步驟繁瑣，成本較高，僅有少量的報(bào)道。文獻(xiàn)調(diào)研表明，提高野生菌株產(chǎn)酶能力的方法主要集中在產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化、傳統(tǒng)誘變育種及基因組重排等技術(shù)領(lǐng)域。大量的研究結(jié)果表明培養(yǎng)基優(yōu)化對(duì)菌體產(chǎn)酶量提高通常不明顯，傳統(tǒng)誘變技術(shù)具有盲目性和兩面性，誘變育種時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。在原生質(zhì)體融合技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的基因組重排技術(shù)不需預(yù)先掌握微生物的遺傳，只需在了解微生物遺傳性狀的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的定向育種，此方法不但簡(jiǎn)化了選育步驟，縮短了育種周期，而且為經(jīng)過(guò)多年誘變對(duì)理化誘變已不敏感的菌株提供新的改良方法，可以獲得大突變的菌株，因此它也成為發(fā)酵工程中的一種有效而安全的育種工具［5］。

原生質(zhì)體制備和再生是基因組重排技術(shù)中非常重要的兩個(gè)環(huán)節(jié)［6］。目前關(guān)于高產(chǎn)核苷磷酸化酶菌株選育的報(bào)道很多，但通過(guò)基因組重排技術(shù)提高短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶的報(bào)道還未見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的對(duì)產(chǎn)胸苷磷酸化酶短乳桿菌的原生質(zhì)體制備及再生條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用紫外－加熱滅活原生質(zhì)體融合的方法獲得短乳桿菌融合子且對(duì)融合菌株的性質(zhì)進(jìn)行初步分析［7］，為進(jìn)一步通過(guò)基因組重排技術(shù)選育高產(chǎn)胸苷磷酸化酶短乳桿菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

親本:短乳桿菌 E2A(菌體產(chǎn)量高)、短乳桿菌E2B(胸苷磷酸化酶活高)，微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液

種子培養(yǎng)基(g/L):酵母膏10，雙蒸水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母膏10，葡萄糖20，NaCl 5，雙蒸水1 000 mL，pH 7.0 ～7.5。

普通固體培養(yǎng)基:在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.5。

初篩培養(yǎng)基(g/L):酵母膏10，葡萄糖20，NaCl 5，K2HPO4·3H2O2，胸苷 20 mmol，雙蒸水 1 000 mL，pH 7.0～7.5。

再生培養(yǎng)基:普通發(fā)酵培養(yǎng)基中添加蔗糖0.5 mol/L，MgCl220 mmol/L，CaCl220 mmol/L，明膠 25 g/L，牛血清白蛋白(0.45 um微孔濾膜除菌)5 g/L，瓊脂20 g/L。均調(diào) pH 6.5～7.0，以上培養(yǎng)基在115℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 試劑

滲透壓穩(wěn)定劑LPB(Tris-HCl 10 mmol/L，MgCl2·2H2O 20 mmol/L，蔗糖 0.5 mol/L)，pH 6.5，115℃滅菌15 min。

聚乙二醇(PEG 6000)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 酶

溶菌酶(20 000 U/mg solid)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用LPB配制，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌;變?nèi)芫?11 029 U/mg solid)，sigma公司，按照5000 U/mL溶解在0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖溶液中，pH 6.2，0.22 μm微孔過(guò)濾除菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)與收集

從平板上挑取單菌落接種到種子發(fā)酵液中，37℃，110 r/min活化10～12 h，同樣發(fā)酵條件下，按照2%的接種量接入含有0.6%甘氨酸預(yù)處理的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心去上清液收集濕菌體備用。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備及再生

用含不同濃度甘氨酸的發(fā)酵液將短乳桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5 000 r/min離心15 min，棄上清液，然后用無(wú)菌生理鹽水和滲透壓穩(wěn)定劑LPB各洗滌1次，離心去除上清液，收集濕菌體。取菌懸液適當(dāng)稀釋后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)測(cè)定菌濃，濕菌體用LPB懸浮保證菌濃在1～10×108CFU/mL，懸浮液中加入不同濃度的溶菌酶或變?nèi)芫兀?－9］，置于不同溫度恒溫水浴酶解一定時(shí)間，鏡檢觀察原生質(zhì)體的形成情況。酶解后菌液3 000 r/min離心10 min收集原生質(zhì)體，用滲透壓穩(wěn)定劑LPB洗滌1次，最后將原生質(zhì)體懸浮于滲透壓穩(wěn)定劑LPB中。將菌懸液和原生質(zhì)體液分別用無(wú)菌水和滲透壓穩(wěn)定劑梯度稀釋后涂布于普通固體培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24～36 h，測(cè)定短乳桿菌原生質(zhì)體的制備率和再生率［10］。

式中:A為酶解前的總菌落數(shù);B為酶解后未脫壁菌體菌落數(shù);C為酶解后原生質(zhì)體與未脫壁菌體的再生菌落數(shù)之和。

1.2.3 短乳桿菌原生質(zhì)體UV－加熱滅活條件的確定

親本E2A和E2B原生質(zhì)體液等比例混合，調(diào)整菌濃為108CFU/mL。取10 mL親本原生質(zhì)體液于培養(yǎng)皿(φ90 mm)中，置于磁力攪拌器上，用20 W紫外燈距離20 cm照射，取不同照射時(shí)間的處理液涂布于再生培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，確定紫外致死時(shí)間。另取10 mL親本原生質(zhì)體液于無(wú)菌離心管中，置于60℃水浴中熱滅活，取不同加熱時(shí)間的處理液涂布于再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，確定熱滅活時(shí)間。

1.2.4 原生質(zhì)體融合

根據(jù)“致死損傷融合互補(bǔ)”原理［11－13］，將紫外滅活和熱滅活的原生質(zhì)體等量混合，3 000 r/min離心10 min，去上清液，將原生質(zhì)體重懸于0.5 mL滲透壓穩(wěn)定劑 LPB中，加入4.5 mL預(yù)熱至30℃的40%PEG 6000，充分混勻，于30℃水浴中恒溫融合10 min，再加入5 mL滲透壓穩(wěn)定劑LPB終止融合，隨即離心(3 500 r/min，5 min)洗滌1次，再用LPB適當(dāng)稀釋后，取100 μL涂布于再生培養(yǎng)基上，37℃恒溫避光培養(yǎng)48 h篩選融合子。同時(shí)分別用紫外滅活和熱滅活的原生質(zhì)體單獨(dú)融合做對(duì)照觀察融合情況。

1.2.5 短乳桿菌融合子初篩方法建立

將再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛的融合子菌落分別接種到普通固體培養(yǎng)基和初篩培養(yǎng)基上，初篩培養(yǎng)基在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加底物胸苷和磷酸根，胸苷磷酸化酶為胞內(nèi)酶，短乳桿菌在生長(zhǎng)的過(guò)程中，菌體可以利用體內(nèi)胸苷磷酸化酶催化發(fā)酵培養(yǎng)基中的胸苷和磷酸根生成胸腺嘧啶，胸腺嘧啶的生成使得發(fā)酵液在290 nm處吸光值增加，從而可粗略判斷菌體產(chǎn)胸苷磷酸化酶能力。將初篩培養(yǎng)液發(fā)酵10 h后分別用無(wú)菌水和pH 13的NaOH稀釋10倍和100倍測(cè)定其在600 nm和290 nm處吸光值。挑取OD600和OD290較高的融合菌體繼續(xù)進(jìn)行胸苷磷酸化酶活測(cè)定。

他反反復(fù)復(fù)地練習(xí)滑翔，早早便成為了云浮“飛”得最遠(yuǎn)的人。但那種借助外物機(jī)械帶來(lái)的飛行體驗(yàn)，又怎能滿(mǎn)足得了他的心呢？他無(wú)數(shù)次地坐在山巔，仰望無(wú)盡的蒼穹，望著云浮山上空飛過(guò)的雄鷹和鴻雁，望著云浮山下飛過(guò)的雨燕和黃鸝，他無(wú)數(shù)次地想，如果能飛一次，哪怕只有一次，此生也便無(wú)憾事了。

1.2.6 胸苷磷酸化酶活測(cè)定

據(jù)Saunders等人報(bào)道［14］，采用紫外分光光度法測(cè)定反應(yīng)生成的胸腺嘧啶來(lái)表征產(chǎn)酶量。標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)混合液包含一定濃度的濕菌體，25 mmol/L的胸苷，1 mmol/L 的 EDTA，pH 7.3、50 mmol/L 的磷酸鉀緩沖溶液。55℃條件下反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液在沸水中煮沸5 min終止反應(yīng)，離心去除沉淀。上清液用pH 12的NaOH稀釋100倍，然后測(cè)定290 nm的紫外吸光度OD290nm的增值［15］。胸苷磷酸化酶酶活單位定義為:在上述條件下，1 min內(nèi)OD290nm變化0.01所需的濕菌體量定義為短乳桿菌的1 個(gè)酶活力單位［4］。

式中:K為稀釋倍數(shù)(100);T為酶反應(yīng)時(shí)間，min;M為濕菌體質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 短乳桿菌原生質(zhì)體制備率和再生率［16］

2.1.1 短乳桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)

為了確定菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，考察了短乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)過(guò)程。由圖1發(fā)現(xiàn)短乳桿菌生長(zhǎng)速度較快，培養(yǎng)2 h時(shí)開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6 h后達(dá)到穩(wěn)定期。不同生長(zhǎng)期菌體對(duì)溶菌酶的敏感程度有很大差別，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的菌體細(xì)胞壁易被酶解形成原生質(zhì)體，故選取培養(yǎng)5～6 h的菌體進(jìn)行原生質(zhì)體的制備。

圖1 短乳桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 Growth curve of Lactobacillus brevis

2.1.2 甘氨酸濃度對(duì)短乳桿菌原生質(zhì)體制備率及再生率的影響

酶解脫壁前添加甘氨酸可以改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使之發(fā)生松動(dòng)增加其對(duì)溶菌酶的敏感性，由表1可以發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌對(duì)甘氨酸的敏感性隨著濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)甘氨酸濃度達(dá)到0.9%時(shí)，甘氨酸對(duì)菌體生長(zhǎng)又明顯抑制作用，難以獲得原生質(zhì)體，而低濃度的甘氨酸可以明顯提高原生質(zhì)體制備率，對(duì)再生率的作用不大，故實(shí)驗(yàn)中用含0.6%甘氨酸的發(fā)酵液培養(yǎng)菌體至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

表1 甘氨酸對(duì)短乳桿菌原生質(zhì)體制備率與再生率的影響Table 1 Effects of glycine on formation and regeneration rate of protoplast of Lactobacillus brevis

采用不同質(zhì)量濃度的溶菌酶和變?nèi)芫?0℃恒溫酶解短乳桿菌，其原生質(zhì)體的制備率和再生率隨著溶菌酶濃度的增加，逐漸增加，溶菌酶濃度為2 mg/mL時(shí)短乳桿菌原生質(zhì)體制備率和再生率分別為74.1%和53.6%。當(dāng)溶菌酶濃度為4 mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體制備率高達(dá)93.5%，但是再生率僅為22.5%，可能是過(guò)高濃度的溶菌酶，水解完細(xì)胞壁后，會(huì)繼續(xù)水解細(xì)胞膜上的部分蛋白質(zhì)從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，致使原生質(zhì)體不能再生。在2 mg/mL溶菌酶的基礎(chǔ)上添加不同濃度的變?nèi)芫?，結(jié)果顯示變?nèi)芫貙?duì)短乳桿菌作用不明顯。因此綜合考慮原生質(zhì)體制備率和再生率，使用2 mg/mL溶菌酶酶解短乳桿菌制備原生質(zhì)體。

圖2 不同酶種類(lèi)及其質(zhì)量濃度對(duì)短乳桿菌原生質(zhì)體制備率及再生率的影響Fig.2 Effects of types and concentration of enzymes on formation and regeneration rate of protoplast of Lactobacillus brevis

2.1.4 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備率和再生率的影響酶解溫度可以直接影響到酶促反應(yīng)速率和原生質(zhì)體化程度。本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置30、37、40、45℃ 4個(gè)溫度梯度，在2 mg/mL溶菌酶酶解90 min條件下進(jìn)行試驗(yàn)，考察酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備率和再生率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。原生質(zhì)體制備率隨溫度升高而升高，但原生質(zhì)體再生率在37℃時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，達(dá)到最大值56.0%。因此本研究選用37℃作為短乳桿菌制備原生質(zhì)體的最佳酶解溫度。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)短乳桿菌原生質(zhì)體制備率和再生率的影響

圖3 酶解溫度對(duì)短乳桿菌原生質(zhì)體制備率及再生率的影響Fig.3 Effects of enzymolysis temperature on formation and regeneration rate of protoplast of Lactobacillus brevis

將短乳桿菌培養(yǎng)6 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，2 mg/mL溶菌酶在37℃恒溫酶解不同時(shí)間，結(jié)果如圖4。原生質(zhì)體制備率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，酶解2 h時(shí)，原生質(zhì)體的制備率達(dá)到95%，再生率達(dá)到48%，若繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，原生質(zhì)體制備率可達(dá)到100%，但再生率大大降低，故最佳酶解時(shí)間為2 h。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)短乳桿菌原生質(zhì)體制備率及再生率的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time on formation andregeneration rate of protoplast of Lactobacillus brevis

2.2 短乳桿菌原生質(zhì)體UV-加熱滅活時(shí)間確定

2.2.1 短乳桿菌原生質(zhì)體的紫外滅活

由表2可知，使用20 W紫外線(xiàn)距離20 cm照射50 min，短乳桿菌原生質(zhì)體(包括未酶解的菌體)幾乎完全滅活，只有約6.2×10－7的低存活率。因此，短乳桿菌原生質(zhì)體紫外滅活條件為:紫外燈功率20 W，距離20 cm，照射時(shí)間為50 min。

表2 短乳桿菌原生質(zhì)體紫外滅活時(shí)間對(duì)滅活率的影響Table 2 Effect of UV inactivated time on inactivation rate of Lactobacillus brevis protoplast

2.2.2 短乳桿菌原生質(zhì)體的熱滅活

由于熱滅活的原發(fā)作用主要在細(xì)胞質(zhì)中，故加熱溫度不能過(guò)高，本研究在60℃條件下對(duì)短乳桿菌原生質(zhì)體加熱不同時(shí)間以確定其完全致死加熱時(shí)間。由表2可知，原生質(zhì)體在60℃水浴中加熱60 min，存活率僅為3.2×10－7，故熱滅活條件為:60℃水浴加熱60 min。

表3 短乳桿菌原生質(zhì)體熱滅活時(shí)間對(duì)滅活率的影響Table 3 Effect of heating inactivated time on inactivation rate of Lactobacillus brevis protoplast

2.3 融合子的篩選

紫外使細(xì)胞致死的原發(fā)作用點(diǎn)主要在DNA上，熱滅活的原發(fā)作用主要在細(xì)胞質(zhì)中，雙親滅活原生質(zhì)體融合后獲得重組體的機(jī)制是細(xì)胞致死率損傷經(jīng)過(guò)融合得以互補(bǔ)的結(jié)果，使用雙親滅活融合獲得重組子可以減少對(duì)親株的遺傳標(biāo)記工作，使融合子的檢出變得直觀，提高篩選融合子的效率［11］。分別以紫外滅活和加熱滅活的原生質(zhì)體單獨(dú)做融合觀察雙親滅活原生質(zhì)體融合情況。

2.3.1 融合子初篩

前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，20 mmol/L胸苷和2 g/L磷酸根對(duì)短乳桿菌菌體生長(zhǎng)影響不顯著，短乳桿菌可以直接利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的胸苷和磷酸根在其胸苷磷酸化酶的作用下生成胸腺嘧啶，從而使發(fā)酵液在290 nm出的吸光值增加，圖5為融合子初篩結(jié)果，短乳桿菌原生質(zhì)體經(jīng)過(guò)融合后菌體產(chǎn)量和酶活都稍有提高，融合子F15、F16、F17產(chǎn)菌體量和酶活提高較其他融合子顯著，故對(duì)這3株融合子繼續(xù)進(jìn)行酶活測(cè)定及菌株穩(wěn)定性測(cè)試。

圖5 融合子菌體生長(zhǎng)及胸苷磷酸化酶活初篩試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of cell growth and thymidine phosphorylase for the fusant

2.3.2 融合子F15、F16、F17酶活測(cè)定及遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

初篩挑選出的融合菌株F15、F16、F17分別測(cè)試其菌體發(fā)酵量和胸苷磷酸化酶活，以親本E2A和E2B為對(duì)照，測(cè)試結(jié)果如表4。從表4可以看到，融合子菌體發(fā)較量和胸苷磷酸化酶活均有提高，其中F15酶活提高50%，達(dá)到1.538 U/mg濕菌體，菌體發(fā)較量也略有提高，對(duì)融合子F15五次傳代后，改菌株產(chǎn)胸苷磷酸化酶活穩(wěn)定在1.500 U/mg濕菌體左右。

表4 產(chǎn)胸苷磷酸化酶親本E2A、E2B和融合菌株的酶活性能比較Table 4 Comparison of thymidine phosphorylase for parent strains E2A，E2B and fusants

3 結(jié)論

3.1 原生質(zhì)體的制備與再生

合適的菌齡、菌體濃度及酶解條件是原生質(zhì)體制備與再生成功的前提條件［17］。對(duì)數(shù)期的菌體生理狀態(tài)一致，代謝旺盛，菌體活性高，對(duì)酶的敏感性強(qiáng)，故易于原生質(zhì)體化與再生;不同種屬的微生物在制備原生質(zhì)體時(shí)所需的酶種類(lèi)和濃度不同。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)短乳桿菌對(duì)變?nèi)芫夭幻舾?，?duì)溶菌酶較敏感，2 mg/mL的溶菌酶有利于短乳桿菌原生質(zhì)體的制備與再生;酶解溫度可以直接影響到酶促反應(yīng)速率和原生質(zhì)體化程度，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溶菌酶酶解短乳桿菌細(xì)胞壁的最適酶解溫度為37℃;酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的形成和再生起著重要作用，酶解時(shí)間太短，細(xì)胞壁脫壁不完全，易再生，但原生質(zhì)體形成率低，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，脫壁完全，原生質(zhì)膜易被酶液破壞，原生質(zhì)體再生率低，不利于融合子的形成，綜合以上影響因素確定短乳桿菌原生質(zhì)體制備與再生的較佳條件為:菌體發(fā)酵至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，調(diào)整菌濃為108CFU/mL時(shí)，用2 mg/mL溶菌酶在37℃恒溫水浴中酶解2 h，此時(shí)原生質(zhì)體的制備率和再生率分別達(dá)到95%和48%左右，有利于后續(xù)原生質(zhì)體融合及基因組重排等技術(shù)開(kāi)展［18］。

3.2 短乳桿菌原生質(zhì)體融合及融合子性質(zhì)

與傳統(tǒng)誘變相比，原生質(zhì)體融合具有集中雙親本優(yōu)良性狀的優(yōu)勢(shì)，原生質(zhì)體選育優(yōu)良性狀融合菌株的方法已有很多研究。工業(yè)微生物雜交育種必須對(duì)親株進(jìn)行遺傳標(biāo)記，本研究利用雙親滅活的方法對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行融合，可以省去親本遺傳標(biāo)記這步繁瑣的工作。文獻(xiàn)資料顯示，雙親皆用UV滅活仍有一定的重組率，皆用熱滅活時(shí)，重組率為零。根據(jù)“致死損傷融合互補(bǔ)”原理，對(duì)親本原生質(zhì)體分別進(jìn)行UV滅活50 min，熱滅活60 min，用40%化學(xué)融合劑PEG 6000在30℃水浴中融合10 min，挑取再生培養(yǎng)基上的融合子進(jìn)行初篩和復(fù)篩，融合菌株的菌體發(fā)酵量和產(chǎn)胸苷磷酸化酶的能力均有提高，融合子F15的酶活達(dá)到1.538 U/mg濕菌體，經(jīng)過(guò)5次傳代后進(jìn)行酶活測(cè)試，酶活均維持在1.500 U/mg濕菌體，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

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