泊洛沙姆對再生絲素蛋白凝膠化結(jié)構(gòu)及形態(tài)的影響

鄧春閩，鐘天翼，許亞娟，岳曉曉，明津法，左保齊

(現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室，江蘇蘇州215123;蘇州大學(xué)紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇蘇州215006)

絲素蛋白(SF)是由家蠶絲腺內(nèi)皮細(xì)胞合成、分泌而成的一種天然蛋白質(zhì)，可從蠶絲中提取，富含甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等20種氨基酸［1］。絲素具有優(yōu)良的物理機械性能［2］、降解性能［3］，用作生物材料時對機體無毒性、致敏性和刺激作用，降解產(chǎn)物不會引起炎癥反應(yīng)［4］，與人體組織有優(yōu)良的生物相容性，被認(rèn)為是一種有望在醫(yī)用材料領(lǐng)域開發(fā)利用的天然高分子材料。

在一定條件下，由于親疏水、氫鍵、靜電等多種因素共同作用，再生絲素蛋白(RSF)溶液容易發(fā)生凝膠化，其分子結(jié)構(gòu)由無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)［5］。該凝膠柔軟、可塑，對于氣體、低分子物質(zhì)或某些高分子物質(zhì)具有選擇透過性，是制備人工皮膚、隱形眼鏡、藥物緩釋載體、酶固定化載體、細(xì)胞培養(yǎng)支架等生物醫(yī)用材料的良好載體［6-8］。再生絲素蛋白溶液的凝膠化過程因受絲素濃度、溫度、pH值、金屬離子和剪切作用等因素影響，在人生理條件下凝膠速度較慢，限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

泊洛沙姆(Poloxamer)作為聚氧乙烯-聚氧丙烯醚嵌段共聚物，是一種新型的高分子非離子表面活性劑，其親油基為聚氧丙烯，親水基為聚氧乙烯，相對分子質(zhì)量分布范圍為1 000～7 000。非離子型表面活性劑在水溶液中不電離，其親水基主要是由具有一定數(shù)量的含氧基團(醚基或羥基)與水構(gòu)成氫鍵從而實現(xiàn)溶解，正是這一特點決定了非離子型表面活性劑在某些方面比離子型優(yōu)越。而且泊洛沙姆作為一類優(yōu)良的藥物制劑新輔料，無毒，對皮膚粘膜無刺激性、過敏性，對人體十分安全，現(xiàn)已廣泛用于制藥工業(yè)，主要作乳化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和分散劑。組成泊洛沙姆的聚氧乙烯﹣聚氧丙烯的比例及各自相對分子質(zhì)量的不同，可以使其擁有不同的親油水平衡值，即不同的親疏水性。由于再生絲素蛋白溶液的凝膠化涉及親疏水作用，而泊洛沙姆具有可調(diào)的親疏水性，所以選擇泊洛沙姆來調(diào)控再生絲素蛋白溶液的凝膠化轉(zhuǎn)變，可擴大絲素水凝膠在生物醫(yī)用方面的應(yīng)用。

本研究主要通過泊洛沙姆與再生絲素蛋白溶液共混，加快絲素溶液的凝膠化轉(zhuǎn)變速度，并對由不同相對分子質(zhì)量的泊洛沙姆和共混比例形成的RSF-Poloxamer水凝膠的結(jié)構(gòu)和形態(tài)進行了分析，探討了泊洛沙姆的親疏水性對再生絲素蛋白溶液凝膠化的影響。

1 實驗

1.1 實驗材料

無水碳酸鈉(Na2CO3)(化學(xué)純，上海興達(dá)化學(xué)試劑廠);溴化鋰(LiBr·H2O)(化學(xué)純，上海恒信化學(xué)試劑有限公司);桑蠶絲(浙江湖州);不同相對分子質(zhì)量的泊洛沙姆:泊洛沙姆P188(相對分子質(zhì)量1 800，聚氧乙烯80%)，泊洛沙姆P338(相對分子質(zhì)量3 300，聚氧乙烯80%)，泊洛沙姆P407(相對分子質(zhì)量4 000，聚氧乙烯70%)(Sigma，美國)。

1.2 RSF-Poloxamer水凝膠

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的碳酸鈉溶液對桑蠶絲脫膠，浴比1︰20，在沸水中煮30 min，然后用去離子水洗滌，如此反復(fù)進行3次。

將脫膠的桑蠶絲溶于LiBr︰C2H5OH=40︰60溶液中，恒溫(80±2)℃水浴攪拌溶解獲得再生絲素溶液，經(jīng)冷卻以后，將絲素溶液注入8 000～14 000的透析袋中，用自來水流動透析1 d，再用去離子水透析2 d，得到純絲素水溶液。最后將絲素水溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)控到3%。

將不同相對分子質(zhì)量的泊洛沙姆與再生絲素水溶液分別以 3種質(zhì)量比 1︰3、1︰1、3︰1共混均勻，37℃靜置至形成水凝膠。將制備好的RSF-Poloxamer水凝膠置于冰箱中冷凍1 d。然后再將冷凍樣品放入臺式冷凍干燥機(LGJ，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)，－50℃下冷凍干燥3 d后，取出干燥凝膠準(zhǔn)備測試。

1.3 主要測試方法

采用美國Nicolet5700型的紅外光譜儀進行測試，波數(shù)范圍為2 000 cm－1～1 000 cm－1，光譜分辨率為4 cm－1，得到凝膠的分子結(jié)構(gòu);采用荷蘭PANalytical公司的X Pert-Pro MPD全自動X射線衍射儀(CuKα射線，管電壓40 kV，管電流40 mA，掃描速度2 °/min，衍射角度2θ為5°～45°)測得凝膠的結(jié)晶結(jié)構(gòu);采用美國TA公司熱分析儀(高純氮氣保護，氮氣流量20.0 mL/min，溫度范圍 50.00 ～600.00 ℃，升溫速率10.00℃/min)測定樣品的熱性能變化。采用日本日立公司S4800掃描電鏡觀察凝膠的橫縱截面形態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 泊洛沙姆對再生絲素溶液凝膠化時間的影響

純絲素溶液在實驗條件下(37℃)要2周以上才能形成水凝膠，從泊洛沙姆對再生絲素溶液凝膠化時間的影響(表1)可以明顯看出，泊洛沙姆與再生絲素共混后極大地加速了再生絲素的凝膠化轉(zhuǎn)變，并且共混溶液中泊洛沙姆的相對分子質(zhì)量越小，所占的共混比例越大，其凝膠化時間越短。同時，結(jié)果還表明，可以通過調(diào)節(jié)泊洛沙姆的相對分子質(zhì)量和共混比例這兩個因素來控制RSF-Poloxamer水凝膠的凝膠速度，有望在短時間內(nèi)快速形成水凝膠。

表1 不同相對分子質(zhì)量和共混比例組成的RSF-Poloxamer溶液的凝膠化時間Tab.1 Gelation time of RSF-Poloxamer solution with different relative molecular masses and blending ratios

泊洛沙姆屬于非離子型表面活性劑，親水親油平衡值(HLB值)表示表面活性劑親水或親油能力的大小。HLB值越大，其親水性越強，HLB值越小，其親油性越強。親水親油轉(zhuǎn)折點為HLB=10時，小于10時為親油性，大于10為親水性。根據(jù)HLB=7+4.02 log(1/［CMC］)，(CMC 為表面活性劑的臨界膠束濃度)，可以得出泊洛沙姆的HLB值(表2)。

表2 不同泊洛沙姆的HLB值Tab.2 HLB quantitative values of different poloxamers

由表2可見，泊洛沙姆的HLB值均大于10，所以都屬于親水性，且P188親水性最強，這與其相對分子質(zhì)量較小有關(guān)。比較RSF-Poloxamer水凝膠的凝膠化時間規(guī)律可以得出:泊洛沙姆的相對分子質(zhì)量越小，其親水性越強，促進再生絲素溶液凝膠化的轉(zhuǎn)變越快。

2.2 分子構(gòu)象研究(FTIR)

紅外光譜法具有操作簡單、重復(fù)性好、精度較高等優(yōu)點，同時又可以對結(jié)構(gòu)進行深入研究，在聚合物材料的應(yīng)用研究中受到學(xué)者的廣泛關(guān)注［9］。圖1A、B、C分別為泊洛沙姆P188、P338和P407與再生絲素溶液共混形成RSF-Poloxamer水凝膠后的紅外光譜圖。

圖1 不同相對分子質(zhì)量和共混比例組成的RSF-Poloxamer水凝膠與純絲素水凝膠的對比紅外光譜圖Fig.1 Comparison of infrared spectrogram of RSF-Poloxamer hydrogel with different relative molecular masses and blending ratios and pure silk fibroin hydrogel

絲素的酰胺I區(qū)(1700～1600 cm－1)散射峰和酰胺Ⅱ區(qū)(1600～1500 cm－1)散射峰指認(rèn)目前已比較成熟，純絲素水凝膠酰胺I和酰胺Ⅱ的特征峰分別在1625cm－1和1517cm－1，蛋白質(zhì)二次結(jié)構(gòu)都?xì)w屬于β-折疊構(gòu)象，可見純絲素水凝膠以β-折疊構(gòu)象為主。RSF-Poloxamer水凝膠的酰胺I和酰胺Ⅱ的特征峰分別在1625cm－1和1525cm－1左右，其蛋白質(zhì)二次結(jié)構(gòu)也主要歸屬于β-折疊構(gòu)象。對比純絲素水凝膠，其酰胺I的特征峰位置幾乎沒有改變，但酰胺Ⅱ的特征峰位置則略往高波數(shù)偏移，說明不同相對分子質(zhì)量和共混比例的泊洛沙姆對絲素二次結(jié)構(gòu)的改變很小，在RSF-Poloxamer水凝膠中，絲素分子仍然是以β-折疊構(gòu)象為主。這個結(jié)果也表明，泊洛沙姆只是加快了再生絲素溶液凝膠化中的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變過程，并沒有或者很少改變其最終形成水凝膠后的結(jié)構(gòu)。

2.3 結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析(XRD)

圖2A、B、C分別為泊洛沙姆P188、P338和P407與再生絲素溶液共混形成SF-Poloxamer水凝膠后的XRD譜圖。

一般認(rèn)為絲素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)分為:無定形結(jié)構(gòu)、Silk I和SilkⅡ結(jié)構(gòu)。其中Silk I的主要衍射峰為12.2、19.7、24.7°和 28.2°，而 Silk Ⅱ的主要衍射峰為 9.1、18.9、20.7°和 24.0°。

圖2 不同相對分子質(zhì)量和共混比例組成的RSF-Poloxamer水凝膠與純絲素水凝膠的XRD譜圖Fig.2 XRD spectrograms of RSF-Poloxamer hydrogel with different relative molecular masses and blending ratios and pure silk fibroin hydrogel

如圖2所示，純絲素水凝膠的主要衍射峰在20.7°，屬于SilkⅡ結(jié)晶衍射峰;當(dāng)泊洛沙姆與絲素共混形成RSF-Poloxamer水凝膠后，其共混水凝膠的圖譜則表現(xiàn)為純絲素與泊洛沙姆各自衍射峰的疊加。當(dāng)泊洛沙姆含量較低時，即與再生絲素溶液1︰3混合時，這種疊加不明顯。但隨著泊洛沙姆含量的增加，這種衍射峰的疊加變得更加明顯，均在 19.1°、23.2°處出現(xiàn)了明顯的特征衍射峰，并且與泊洛沙姆相對分子質(zhì)量的大小無關(guān)，說明這是泊洛沙姆的特征結(jié)晶峰。同時，這也表明了RSF-Poloxamer共混水凝膠中存在著絲素與泊洛沙姆兩種結(jié)晶結(jié)構(gòu)，兩者只是單純的共混并且相分離。

2.4 熱性能分析(DTA)

圖3A、B、C分別為泊洛沙姆P188、P338和P407與再生絲素溶液共混形成RSF-Poloxamer水凝膠后的DTA譜圖。

圖3 不同相對分子質(zhì)量和共混比例組成的RSF-Poloxamer水凝膠與純絲素水凝膠的DTA譜圖Fig.3 DTA spectrograms of RSF-Poloxamer hydrogel with different relative molecular masses and blending ratios and pure silk fibroin hydrogel

如圖3所示，純絲素凝膠在292℃有一個明顯的熱分解峰，主要歸因于純絲素水凝膠內(nèi)大量β-折疊構(gòu)象的緣故。當(dāng)泊洛沙姆與再生絲素共混形成RSFPoloxamer水凝膠后，其熱分解峰仍然在292℃左右，基本沒有太大變化，說明了共混水凝膠中絲素還是含有大量的β-折疊構(gòu)象。這與紅外光譜測試的結(jié)果是一致的:泊洛沙姆只是加快了再生絲素溶液凝膠化中的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變過程，并沒有或者很少改變其最終形成水凝膠后的結(jié)構(gòu)。

2.5 形態(tài)結(jié)構(gòu)與分析(SEM)

如圖4所示為絲素溶液分別和泊洛沙姆P188、P338、P407以不同比例共混后形成的SF-Poloxamer水凝膠冷凍干燥后的掃描電鏡圖。A、B、C為P188與再生絲素以 1︰3、1︰1、3︰1 質(zhì)量比共混;D、E、F 為P388 與再生絲素以3︰1、1︰1、1︰3 質(zhì)量比共混;G、H、I為 P407 與再生絲素以3︰1、1︰1、1︰3 質(zhì)量比共混。

圖4 絲素溶液分別和泊洛沙姆P188、P338、P407以不同比例共混后形成的RSF-Poloxamer水凝膠冷凍干燥后的SEM照片F(xiàn)ig.4 SEM photograph of frozen and dried RSF-Poloxamer hydrogel prepared by silk fibroin solution respectively blending with Paloxamers P188，P338 and P407 in different ratios

從圖4可以看出，雖然含有不同泊洛沙姆及共混比例的RSF-Poloxamer凝膠形態(tài)均有不同的變化，但是其總體都呈現(xiàn)為片層狀結(jié)構(gòu)，一般認(rèn)為這是由于其凝膠化過程中大量絲素分子由無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)所致，這與結(jié)構(gòu)測試的結(jié)果是一致的。同時，隨著共混比例中泊洛沙姆的增加，RSF-Poloxamer凝膠的片層結(jié)構(gòu)變得越來越規(guī)整。

3 結(jié)論

1)將不同相對分子質(zhì)量泊洛沙姆與絲素溶液以不同比例混合形成RSF-Poloxamer凝膠，并用FTIR、XRD、DTA、SEM對水凝膠進行了結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明，泊洛沙姆可以明顯加速再生絲素蛋白溶液的凝膠化過程，并且對其形成水凝膠后的結(jié)構(gòu)和形態(tài)影響很小。

2)RSF-Poloxamer凝膠可以通過調(diào)節(jié)泊洛沙姆的相對分子質(zhì)量和共混比例這兩個因素來控制RSFPoloxamer水凝膠的凝膠速度，有望在短時間內(nèi)快速形成水凝膠，從而擴寬了絲素水凝膠的應(yīng)用范圍。

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