桑樹(shù)泛素延伸蛋白基因的原核表達(dá)

周曉慧，戴 斌，王 韡，陸小平

(蘇州大學(xué)金螳螂建筑與城市環(huán)境學(xué)院，江蘇蘇州215123)

泛素延伸蛋白(UEP)也稱(chēng)泛素羧端延伸蛋白(CEP)，是氨端一個(gè)泛素分子和羧端一個(gè)核糖體蛋白(RLP)分子的融合蛋白。UEP基因轉(zhuǎn)錄和翻譯后的產(chǎn)物為前體蛋白，將在脫泛素酶(DUB)作用下形成泛素和核糖體蛋白［1］。真核生物中的泛素延伸基因分為兩類(lèi):一類(lèi)C末端與52或53個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)融合，這類(lèi)融合的蛋白與核糖體L40(ribosomal L40)有很高的同源性;另一類(lèi)與76～80個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)融合，這類(lèi)融合的蛋白質(zhì)與核糖體S27a蛋白(ribosomal S27a)有很高的同源性。

泛素延伸蛋白的研究最早是在酵母中［2］，后在人類(lèi)、線(xiàn)蟲(chóng)、擬南芥和水稻等物種中均克隆出編碼該類(lèi)蛋白的基因［3-4］。目前，國(guó)內(nèi)外泛素延伸蛋白的研究主要集中在人、動(dòng)物、昆蟲(chóng)等領(lǐng)域［5］，如小菜蛾［6］、煙葉蛾［7］、甜菜夜蛾［8］泛素延伸蛋白基因克隆與表達(dá)的研究，而在植物中有關(guān)泛素延伸蛋白基因的研究很少。尤其是該基因在植物生物學(xué)功能中的調(diào)控作用及其作用機(jī)理還不清楚［9-10］。陸月賞等［11］利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)玉米泛素延伸蛋白基因(ZmERD16)的組織表達(dá)特異性和在不同脅迫條件下的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，認(rèn)為ZmERD16可能參與玉米的多種脅迫信號(hào)傳導(dǎo)和逆境應(yīng)答。目前，對(duì)木本植物泛素體系的研究尚處于起步階段［12］。在前期的工作中，利用3'RACE技術(shù)，從豐馳桑幼葉的總RNA中反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增出植物泛素延伸蛋白基因cDNA［10］。本研究對(duì)前期克隆的桑樹(shù)泛素延伸蛋白基因進(jìn)行了生物信息學(xué)及原核表達(dá)分析，為進(jìn)一步探討桑樹(shù)的逆境生理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

pGEM-T/Ube質(zhì)粒(含有泛素延伸蛋白基因)、表達(dá)菌株E.coli BL 21、表達(dá)載體pGEX-4T-1均為植物栽培與生理實(shí)驗(yàn)室保存。pGEM-T/Ube質(zhì)粒、pGEX-4T-1經(jīng)Bam HI和Eco RI雙酶切后，分別回收目的片段，用 T4 DNA連接酶14℃連接過(guò)夜，取10μL轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子送交至上海捷瑞生物有限公司鑒定和測(cè)序后保存。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

LB液體培養(yǎng)基、Tris緩沖液、過(guò)硫酸銨(AP)、考馬斯亮藍(lán)、氨芐青霉素(Amp)、Bam HI/Eco RI均購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，IPTG購(gòu)自Novagen公司。

1.3 菌體培養(yǎng)

取3 mL LB液體培養(yǎng)基加Amp至質(zhì)量濃度為50μg/mL，加入經(jīng)鑒定含有陽(yáng)性pGEX-4T-1的質(zhì)粒菌，在200 r/min、37℃條件下恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日按1%比例在新鮮培養(yǎng)基中加入200μL活化菌液接種到LB/Amp培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。

當(dāng)菌液濃度OD600值約為0.5時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG使其終濃度為1.0 mmol/L進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)。在不同時(shí)間段對(duì)樣品進(jìn)行取樣，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品處理及SDS-PAGE電泳

［13］操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒鑒定

抽取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，并用Ba m HI和Eco RI雙酶切，酶切結(jié)果如圖1所示，雙酶切后出現(xiàn)大小在500 bp左右的片段，與測(cè)序結(jié)果一致。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明:目的片段大小為471 bp，上游有一個(gè)起始密碼子ATG，下游有一個(gè)終止密碼子TAG，兩者之間是一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼156個(gè)氨基酸。說(shuō)明重組質(zhì)粒載體中含有桑樹(shù)泛素延伸蛋白基因片段，表達(dá)載體構(gòu)建正確。

2.2 基因產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析

根據(jù)所獲基因推演的蛋白序列可知，該蛋白的推測(cè)pI值是5.14，相對(duì)分子質(zhì)量為17 800。卷曲螺旋是控制蛋白質(zhì)寡聚化的元件，通過(guò)網(wǎng)站http://www.ch.embnet.org/cgi-bin/COILS_form_parser對(duì)卷取區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果如圖2所示:在第10～40個(gè)氨基酸區(qū)域有存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的可能。

圖1 重組質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid

圖2 重組質(zhì)粒卷曲螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of coiled-coil structure of recombinant plasmid

2.3 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

在37℃，200 r/min條件下，經(jīng)濃度1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間桑樹(shù)泛素延伸蛋白基因蛋白的表達(dá)量。結(jié)果如圖4中箭頭所示:表明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)0～6 h內(nèi)泛素延伸蛋白表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量明顯增加，6 h時(shí)表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL 21(pGEX-4T-1)只能看到非常淺的條帶，這與生物信息預(yù)測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明目的基因能夠在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。

圖3 桑樹(shù)泛素延伸蛋白跨膜結(jié)構(gòu)Fig.3 Transmembrane structure of ubiquitin extension protein in mulberry

圖4 桑樹(shù)泛素延伸蛋白基因轉(zhuǎn)化BL 21不同時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)Fig.4 Inducible expression of mulberry ubiquitin extension protein gene transforming BL 21 at different time

3 結(jié)論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)表明，桑樹(shù)泛素延伸蛋白基因與其他植物具有較高的同源性［5］，這使得今后利用模式植物研究其功能及分子進(jìn)化分析更加高效。此外，該基因能夠在原核細(xì)胞大腸桿菌中正確表達(dá)，37℃條件下，經(jīng)1.0 mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)后，在相對(duì)分子質(zhì)量為40 000前后有明顯的條帶出現(xiàn)，這與預(yù)測(cè)結(jié)果(目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量17 800和pGEX-4T中的GST蛋白相對(duì)分子質(zhì)量26 000的融合產(chǎn)物)一致，蛋白表達(dá)量隨時(shí)間的推移顯著增加。劉嘉琦等［13］只對(duì)不同溫度及不同載體對(duì)泛素延伸蛋白的表達(dá)影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在30℃條件下0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h表達(dá)量最高。由于本實(shí)驗(yàn)僅在不同時(shí)間對(duì)目的基因原核表達(dá)影響進(jìn)行了研究，經(jīng)1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h后，在相對(duì)分子質(zhì)量40 000前后有明顯條帶，但尚未因溫度、誘導(dǎo)劑濃度等不同條件對(duì)原核表達(dá)影響進(jìn)行研究。目前對(duì)泛素延伸蛋白基因表達(dá)機(jī)理尚不清楚，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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