HPLC法測(cè)定大鼠血漿中曲安奈德的含量

謝靜,張迎慶

(湖北工業(yè)大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,湖北 武漢 430068)

曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA),屬于腎上腺糖皮質(zhì)類固醇,分子式為C24H31FO6,為白色或類白色結(jié)晶性粉末.作為一種糖皮質(zhì)激素,曲安奈德具有較強(qiáng)的抗炎和免疫抑制作用[1],用于治療各種皮膚病、過敏性鼻炎、關(guān)節(jié)疼痛、支氣管哮喘、肩周炎、急性扭傷及眼科炎癥等[2].關(guān)于曲安奈德含量測(cè)定的文獻(xiàn)多有報(bào)道[3-4],而對(duì)其在大鼠血漿中進(jìn)行含量測(cè)定的方法報(bào)道則較為少見,本文中采用高效液相色譜法對(duì)大鼠血漿中的曲安奈德進(jìn)行分析,試圖建立有效可行的含量測(cè)定方法,為之后該類藥物的體內(nèi)血藥濃度檢測(cè)及藥動(dòng)學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 儀器與材料

1.1儀器高效液相色譜儀(Ultimate 3000,美國Dionex公司);Chromeleon色譜工作站(美國Dionex公司);高頻數(shù)控超聲波清洗器(KQ-300TDB,昆山市超聲儀器有限公司);電子分析天平(AR 3130型,梅特勒-托利多儀器上海有限公司).

1.2藥品與試劑曲安奈德原料藥(NET 101101,天津天藥藥業(yè)股份有限公司);曲安西龍(內(nèi)標(biāo),天津天藥藥業(yè)股份有限公司);乙酸乙酯(分析純);甲醇(色譜純).

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)Wistar 雌性大鼠,體重250～300 g,湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):4200600867.

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 曲安奈德標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱定曲安奈德原料藥適量,用流動(dòng)相溶解得到濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置4 ℃下,用前避光.

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱定曲安西龍適量,用流動(dòng)相溶解得到濃度為50 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,置4 ℃下,用前避光.

2.2血漿樣品的處理于大鼠股動(dòng)脈活體取血后即時(shí)離心(10 000 r/min),取上層血清,置-20 ℃下備用,用前解凍.精密吸取血漿樣品0.2 mL,置5 mL具塞離心管中,加入乙酸乙酯2 mL,搖勻,旋渦混合10 min,離心(8 000 r/min)后取上層有機(jī)相1 mL,揮干,殘?jiān)?.2 mL流動(dòng)相溶解,旋渦混合5 min后,半透膜(20 ku)過濾,20 μL進(jìn)樣,HPLC測(cè)定.

2.3 血漿中曲安奈德HPLC測(cè)定方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Dionex C18柱;流動(dòng)相:甲醇∶水=57∶43(體積分?jǐn)?shù));檢測(cè)波長:240 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:20 μL.

2.3.2 專屬性考察 在上述色譜條件下,空白血漿、空白血漿加曲安奈德和內(nèi)標(biāo)溶液、血漿樣品的色譜圖、未添加曲安奈德的血漿樣品色譜圖如圖1所示.結(jié)果表明,血漿中的內(nèi)源物質(zhì)不干擾曲安奈德及內(nèi)標(biāo)的分析測(cè)定.

2.3.3 血漿中曲安奈德標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取曲安奈德(TA)對(duì)照品溶液,用流動(dòng)相分別稀釋成濃度為0.6、3.0、6.0、24.0、96.0、192.0 μg/mL,分別取50 μL,加入大鼠空白血漿200 μL及內(nèi)標(biāo)溶液(internal standard,IS)50 μL,配制成0.1、0.5、1.0、4.0、16.0、32.0、64.0 μg/mL的系列曲安奈德血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液.按“2.2血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作,進(jìn)樣分析,得數(shù)據(jù)結(jié)果如表1.以血漿藥物濃度為橫坐標(biāo)(x),以曲安奈德與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)(y),得線性回歸方程為:y=0.019 9x+0.048 1(相關(guān)系數(shù)r=0.996 1).血漿中曲安奈德的濃度在1～64 μg/mL范圍內(nèi),其峰面積和對(duì)應(yīng)的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,見圖2.

表1 不同濃度下的曲安奈德及內(nèi)標(biāo)與峰面積的關(guān)系

圖2 血漿中曲安奈德含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.4 回收率實(shí)驗(yàn) 取大鼠空白血漿200 μL配制血漿藥物濃度分別為8、10、12 μg/mL的樣品,加內(nèi)標(biāo)50μL每一濃度平行制備3份,按“2.2血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作,進(jìn)樣分析,得到的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得實(shí)際濃度,實(shí)際濃度與理論濃度的比值即為方法回收率.上述低、中、高3個(gè)樣品的方法回收率結(jié)果見表2.

表2 血漿中曲安奈德含量測(cè)定的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.5 精密度試驗(yàn) 對(duì)血漿藥物濃度分別為4、16、64μg/mL的樣品進(jìn)行日內(nèi)及日間精密度考察.每一濃度的樣品平行制備3份,按“2.2血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作,進(jìn)樣分析,測(cè)定峰面積,計(jì)算同一天內(nèi)3個(gè)濃度的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差(RSD).連續(xù)5天每一濃度樣品進(jìn)樣3次,測(cè)定峰面積,計(jì)算日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差(RSD).結(jié)果見表3,同一濃度下的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3%以下,均符合生物樣品指導(dǎo)原則的有關(guān)規(guī)定[5].

表3 血漿中曲安奈德含量測(cè)定的精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一天配制的對(duì)照品溶液,大鼠血漿200μL配制血漿藥物濃度為10μg/mL的樣品6份,按“2.2血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作,進(jìn)樣分析,結(jié)果見表4.結(jié)果得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.95%,表明重復(fù)性較好.

表4 血漿中曲安奈德含量測(cè)定的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取大鼠空白血漿200μL,分別加入曲安奈德系列對(duì)照品溶液,制成血漿藥物濃度分別為4、16、64 μg/mL的樣品,按“2.2血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作,分別于0、6、12 h進(jìn)樣分析,記錄色譜峰面積,見表5.結(jié)果表明樣品室溫放置12 h穩(wěn)定.

表5 血漿中曲安奈德含量測(cè)定的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

目前常用的血漿樣品預(yù)處理方法有液-液提取法、液固提取法、直接除蛋白法等.因曲安奈德為親脂性較強(qiáng)的藥物,可溶于多種有機(jī)溶劑,本試驗(yàn)選用液-液提取法.在血漿樣品提取過程中,比較了氯仿和乙酸乙酯,發(fā)現(xiàn)氯仿對(duì)曲安奈德的提取率相當(dāng)?shù)?HPLC測(cè)定中幾乎無藥物峰出現(xiàn),而乙酸乙酯的提取率很高,回收率試驗(yàn)中其平均提取回收率在90%以上,同時(shí)曲安奈德與內(nèi)標(biāo)物及血漿內(nèi)源物質(zhì)分離度高,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,證明該方法作為大鼠血漿中曲安奈德含量測(cè)定的方法是有效可行的.

[1] 彭穗偉,李益中.曲安奈德的藥理作用及臨床作用[J].新醫(yī)學(xué),2001,32(1):45-46.

[2] 陳新謙,金有豫,湯光,等.新編藥物學(xué)[M].人民衛(wèi)生出版社,2011:626.

[3] Pan Zu-ting, Yu Jun-ping. Spectrofluorimetric method for the determination of triamcinolone acetonide[J]. Wuhan University Journal of Natural Sciences,2004,9(3):353-358.

[4] 鐘小燕.HPLC法測(cè)定醋酸曲安奈德薄荷軟膏中醋酸曲安奈德的含量[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2012,19(19):79-82.

[5] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:二部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:173-179.