土壤加砷對大豆葉綠素、脯氨酸和過氧化氫酶活性的影響

牛昌美,楊蘭芳,彭小蘭,裴艷艷

(1.湖北大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,湖北 武漢 430062;2.中國科學(xué)院土壤研究所,江蘇 南京 210008)

0 引言

砷廣泛分布于自然界中,可以通過自然、工業(yè)活動和農(nóng)業(yè)利用進(jìn)入環(huán)境,很多國家和地區(qū)如印度、孟加拉、泰國、尼泊爾、美國、中國等都有嚴(yán)重的砷污染問題[1],砷是動植物的非必需元素,礦業(yè)及冶煉、化石燃料燃燒、含砷物質(zhì)和肥料的利用、城市和工業(yè)廢棄物的處置等人類活動是環(huán)境砷污染的主要來源[2].如英格蘭西北部的礦區(qū)土壤中砷的含量高達(dá)200 g kg-1,園藝?yán)煤榈臍⑾x劑可使土壤表層砷含量達(dá)到124 mg kg-1[3].砷是自然界中毒性最大的元素之一,砷及其化合物具有致癌性、致突變性和致畸性[4-5].砷對植物也具有毒性,土壤砷污染對植物的危害主要表現(xiàn)為阻礙水分在植株內(nèi)運行,影響水分和營養(yǎng)的吸收,并使砷在植物中累積,造成葉綠素的破壞[6].實驗表明,當(dāng)土壤加砷水平達(dá)到50 mg kg-1時,大豆出現(xiàn)中毒癥狀,葉片皺縮,葉色變暗,葉緣焦枯,植株矮化,成熟延遲[7].研究植物對土壤環(huán)境中砷的生理生化響應(yīng)對于正確評價土壤砷污染水平、食品安全和人類健康都具有極其重要的意義.大豆是我國及世界的主要油料作物[8],也是人類植物蛋白質(zhì)的主要來源[9],研究大豆生理指標(biāo)與土壤砷污染之間關(guān)系有助于揭示大豆砷毒害的機理.本研究利用土壤盆栽大豆實驗,通過測定葉綠素、脯氨酸、過氧化氫酶活性等生理指標(biāo),探索土壤砷污染與大豆生理指標(biāo)的關(guān)系,為認(rèn)識大豆對土壤砷污染的生理響應(yīng)和大豆安全生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1土樣的采集與處理實驗所用的土壤為紅壤,屬于鐵鋁土綱,濕熱鐵鋁土亞綱,紅壤土類,棕紅壤亞類.土壤采自武漢市魯磨路南望山山麓旁的荒蕪耕地.土壤從野外采回后,在室內(nèi)攤開,剔除石塊和植物殘體,經(jīng)常翻動使其自然風(fēng)干,然后過5 mm篩混合均勻后備盆栽試驗之用.從中取約500 g土壤再過1 mm篩后混合均勻,從中再取約50 g土樣磨細(xì)過0.15 mm篩混合均勻.過0.15 mm篩的土壤供測定土壤有機質(zhì)之用,過1 mm的土壤樣供測定其余的土壤基本農(nóng)化性質(zhì)之用.土壤基本理化性質(zhì)見表1所示.

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)

供試大豆品種為春大豆,為有限結(jié)莢型,大豆株型較矮,適合盆栽,種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院武漢油料作物研究所提供.

1.2盆栽試驗用圓臺形陶瓷缽作為實驗盆缽,盆缽高15 cm,體積3.2 L.每盆裝土3.0 kg,設(shè)置土壤加砷0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0 mg kg-1總共6個處理,每處理重復(fù)3次.每盆施入相同數(shù)量的基肥,基肥用(NH4)2SO4、KH2PO4和KCl配制成含N、P2O5、K2O分別為21.6、16.2、36.0 mg mL-1的溶液,裝盆時每盆加入此溶液10 mL混勻即可.砷用亞砷酸鈉配制成0、0.6、1.2、3.6、6.0、12.0 mg mL-1的系列溶液,每盆按順序加入相應(yīng)的溶液25 mL,連同肥料一起拌均勻后裝入盆栽缽中,即得土壤加砷0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0 mg kg-1的處理水平.

2009年5月10日裝盆播種,每盆播種籽粒飽滿、大小一致的種子3顆,播種后灌足水分,將所有盆缽放置在1.2 m×2.0 m的可移動推車上,雨天將車推進(jìn)玻璃房內(nèi),非雨天則將車推到玻璃房外的露天里.待苗長至5～8 cm以上時,進(jìn)行間苗,每盆保留長勢較一致的苗1株.實驗期間每天進(jìn)行觀察和水分管理并記錄植物生長狀況.

1.3 化學(xué)分析

1.3.1 葉綠素含量的測定 葉綠素測定了兩次,一次是結(jié)莢期即2009年7月8日采樣測定,第二次是鼓粒期即2009年8月1日采樣測定.剪取大豆新鮮葉片(從上往下,第3片完整葉),立即帶回室內(nèi),洗干凈后用吸水紙吸干水分,去掉中脈剪碎后混勻.稱取剪碎樣品0.2 g,放入25 mL比色管中,加入95%乙醇25 mL,用黑色袋子套住,放在暗處,直到葉片完全變白,在波長665、649、470 nm下分別測定其吸光度,根據(jù)公式計算出葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量[10].

1.3.2 脯氨酸含量的測定 在大豆結(jié)莢期即2009年7月9日采樣測定大豆葉片的脯氨酸含量,利用茚三酮顯色,甲苯萃取分光光度法測定[10].

1.3.3 過氧化氫酶活性的測定 在大豆結(jié)莢期即2009年7月7日采樣測定過氧化氫酶活性,用紫外分光光度法測定[11].

1.3.4 土壤基本理化性質(zhì)用的測定 土壤基本理化性質(zhì)用常規(guī)法分析,即有機質(zhì)用硫酸-重鉻酸鉀外加熱容量法,堿解氮用堿解擴(kuò)散法,速效磷用鉬藍(lán)法分光光度法,速效鉀用火焰光度法,CEC用醋酸銨法,pH用電位法,土壤質(zhì)地用吸管法測定[12].

1.4數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)用Excel 2003計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和作圖,用SPSS10.0進(jìn)行方差分析和多重比較,多重比較方法用LSD法,顯著水平用0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1土壤加砷對大豆葉綠素的影響在結(jié)莢期的采樣測定中(表2),各加砷處理的葉綠素a(ya)、葉綠素b(yb)、類胡蘿卜素(yc)的含量以及葉綠素總量(ya+b)與不加砷的對照之間均無顯著差異,表明在本實驗的條件下,土壤加砷對大豆葉綠素含量的影響不顯著.雖然含量看不出與對照的差異,但葉綠素a與葉綠素b的比值和葉綠素a占總?cè)~綠素的比例則是有顯著差異的.無論是葉綠素a與葉綠素b的比值,還是葉綠素a占總?cè)~綠素的比例,土壤加砷5～30 mg kg-1的處理與對照之間無顯著差異,而加砷50和100 mg kg-1的處理則顯著低于對照.

在鼓粒期的采樣測定中(表3),土壤加砷處理顯著影響大豆葉片的葉綠素含量.葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量中,土壤加砷5、10、30 mg kg-1的處理與對照無顯著差異,而加砷50和100 mg kg-1的處理顯著高于對照.加砷處理的類胡蘿卜素除了10 mg kg-1的處理與對照差異不顯著外,其余處理均顯著高于對照.雖然加砷處理使葉綠素a與葉綠素b的比值有增加的趨勢,但是除了10 mg kg-1的處理之外,其余處理均與對照無顯著差異.葉綠素a所占的比例是5、10、30 mg kg-1的處理與對照無顯著差異,加砷50和100 mg kg-1處理的顯著高于對照.土壤加砷使葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量和類胡蘿卜素的最大增加率分別為119.8%、111.0%、117.2%和105.6%.

表2 大豆結(jié)莢期的葉綠素含量與構(gòu)成

ya、yb、ya+b、ya/yb、ya/ya+b分別表示葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量、葉綠素a與葉綠素b的比值、葉綠素a占葉綠素總量的百分率,下同.

2.2土壤加砷量對大豆脯氨酸含量的影響圖1表明,土壤加砷處理對大豆葉片脯氨酸含量有顯著影響.在土壤加砷0～10 mg kg-1的范圍內(nèi),大豆葉片脯氨酸含量呈增加的趨勢,但是統(tǒng)計分析表明,加砷5和10 mg kg-1的處理與對照之間無顯著差異,加砷30、50和100 mg kg-13個處理的脯氨酸含量顯著低于對照和加砷5和10 mg kg-1的處理,但是后三者之間無顯著差異.同對照相比,土壤加砷使大豆葉片脯氨酸含量的降低率在23.4%～31.4%.

表3 大豆鼓粒期的葉綠素含量與構(gòu)成

2.3土壤加砷量對大豆過氧化氫酶含量的影響圖2可見,土壤加砷顯著影響大豆葉片過氧化氫酶活性.在0～50 mg kg-1的土壤加砷范圍內(nèi),過氧化氫酶活性首先呈下降趨勢,當(dāng)土壤加砷水平達(dá)到100 mg kg-1時,過氧化氫酶活性又有回升.統(tǒng)計分析表明,所有增加砷處理的過氧化氫酶活性均顯著低于對照,土壤加砷使過氧化氫酶活性降低了10.7%～46.6%,以加砷50 mg kg-1的過氧化氫酶活性最低.

圖1 土壤砷污染對大豆脯氨酸含量的影響

圖2 土壤加砷對大豆過氧化氫酶活性的影響

3 討論

砷不是植物生長的必須元素,會妨礙植物代謝和抑制植物生長[13],目前砷對植物生長代謝的影響機理認(rèn)識還相當(dāng)欠缺.本實驗結(jié)果表明,土壤加砷影響大豆葉綠素、脯氨酸和過氧化氫酶等生理指標(biāo).

葉綠素是植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的重要色素,它的功能是捕獲光能并驅(qū)動電子轉(zhuǎn)移到反應(yīng)中心,對植物生長和農(nóng)作物產(chǎn)量具有極其重要的作用[14].本實驗證明,在大豆的結(jié)莢期,不同土壤加砷水平下的大豆葉片葉綠素含量無顯著差異,但是加砷50和100 mg kg-1水平下的葉綠素a與葉綠素b的比值以及葉綠素a所占比例顯著低于對照,說明較高的土壤砷水平影響大豆結(jié)莢期的葉綠素構(gòu)成.在大豆鼓粒期,土壤加砷50和100 mg kg-1處理的葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和葉綠素a所占比例均顯著高于對照,說明土壤砷水平既影響大豆鼓粒期的葉綠素含量,也影響葉綠素的構(gòu)成.目前有關(guān)砷與葉綠素關(guān)系的研究不多,利用土壤加入砷酸鈉栽培豌豆的實驗表明,培養(yǎng)32 d后,加砷處理的葉綠素含量增加,而葉綠素a與b的比值降低[15].葉綠素a與b的比值降低的結(jié)果與本實驗結(jié)莢期的結(jié)果一致,葉綠素含量增加的結(jié)果與本實驗鼓粒期的結(jié)果一致.這說明土壤砷污染影響葉綠素含量和構(gòu)成,從而可以通過影響植物光合作用來影響植物的生長.植物成熟延遲也是植物砷毒害的一種表現(xiàn),本實驗表明,大豆鼓粒期高砷水平下葉綠素含量高,與砷毒害延遲植物成熟應(yīng)該是一致的.

脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一,并可以以游離狀態(tài)廣泛存在于植物體中,在干旱、鹽漬等脅迫條件下,許多植物體內(nèi)脯氨酸大量積累,積累的脯氨酸除了作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外,還在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢等方面起重要作用[16-17].如脯氨酸預(yù)處理可以降低鎘脅迫下龍葵的活性氧自由基水平,保護(hù)細(xì)胞原生質(zhì)膜的完整性,從而提高對鎘的耐受能力[18].本實驗表明土壤加砷量30 mg kg-1以下時,脯氨酸含量與對照無統(tǒng)計上的差異,說明低水平的砷不影響大豆的抗逆性,而土壤加砷30 mg kg-1及其以上時,大豆葉片脯氨酸含量顯著低于對照,說明土壤砷水平高達(dá)一定程度時就顯著降低大豆的抗逆性,會使植物更容易受逆境的脅迫.從生長形態(tài)來看,只有在土壤加砷50 mg kg-1下,大豆才有明顯的毒性癥狀表現(xiàn)[11],而從脯氨酸的含量來看,加砷30 mg kg-1下,脯氨酸的含量已顯著低于對照了,而且隨加砷水平的進(jìn)一步增加,脯氨酸的含量差異并不顯著,說明在加砷30 mg kg-1的水平下,大豆已經(jīng)受到了砷毒性的損傷了,因此,本實驗表明,通過生理生化指標(biāo)如脯氨酸含量等,比通過形態(tài)觀察更能盡早地發(fā)現(xiàn)植物是否受到了砷的毒性損傷.

過氧化氫酶是一類廣泛存在于各種微生物和動植物體內(nèi)的一類酶,能夠清除植物體內(nèi)H2O2以保護(hù)植物免受氧化損傷[19].本實驗表明,土壤加砷降低了大豆葉片中的過氧化氫酶活性,說明土壤污染會破壞植物的抗氧化系統(tǒng),從而不利于植物抵抗和修復(fù)氧化損傷.加砷處理降低了綠豆過氧化氫酶活性,從而認(rèn)為砷通過誘導(dǎo)與氧化脅迫相關(guān)的脂質(zhì)過氧化抑制綠豆根系生長[20];加砷的小麥實驗也表明,當(dāng)砷水平超過5 mg kg-1時,砷抑制了過氧化氫同工酶的表達(dá)[21].這些結(jié)果與本實驗的結(jié)果基本一致,這說明砷通過抑制過氧化氫酶等抗氧化酶的活性,增加氧化脅迫而影響植物生長.本實驗結(jié)果中,最低過氧化氫酶活性在土壤加砷50 mg kg-1的處理,而不是最高加砷水平100 mg kg-1,最高加砷處理的過氧化氫酶活性雖然顯著低于對照,但是卻明顯有所回升,回到了跟加砷5 mg kg-1的處理無顯著差異的程度,顯著高于土壤加砷10、30和50 mg kg-1的處理.可能原因應(yīng)該在高砷水平下,植物受到高濃度H2O2脅迫,植物為了避免更大的損傷,會形成過氧化氫酶來分解過氧化氫,盡量較少損傷,因為過氧化氫酶的功能就是分解過氧化氫,對植物起保護(hù)作用.當(dāng)然這有待于進(jìn)一步通過測定過氧化氫的含量、活性氧自由基的含量和與此相關(guān)其它抗氧化酶的活性來驗證.

總之,砷可以通過改變?nèi)~綠素的構(gòu)成和含量而影響植物光合作用,降低植物的抗逆性和抑制植物抗氧化性等方面影響植物生長.

4 結(jié)論

1)土壤加砷對大豆葉綠素的影響在不同時期表現(xiàn)不同,對結(jié)莢期葉綠素含量無顯著影響,但是較高水平的砷降低了葉綠素a與葉綠素b的比值和葉綠素a所占葉綠素總量(ya+b)的比例,較高水平的砷增加大豆鼓粒期的葉綠素含量.

2)土壤加砷達(dá)到一定水平時降低了大豆葉片的脯氨酸含量,加砷100 mg kg-1時,脯氨酸降低了31.4%,表明高砷水平會抑制大豆的抗逆性.

3)土壤加砷使大豆過氧化氫酶活性降低了10.7%～46.6%,說明土壤砷污染會損傷植物的抗氧化系統(tǒng).

4)土壤砷污染通過影響大豆的光合作用、降低抗逆性和破壞抗氧化系統(tǒng)來影響大豆的生長.因此可以通過測定植物生長期間的生理指標(biāo)來判定植物受砷污染損害的狀況.

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