分子印跡阻抗型沙丁胺醇電化學(xué)傳感器的研究

郭春暉,楊瑩瑩,劉蒙,蘇文豪,劉平,徐瑋,張修華,王升富

(湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖北 武漢 430062)

0 引言

沙丁胺醇(SAL)是一種使用廣泛的β-興奮劑,常用于治療喘息型支氣管炎、支氣管哮喘、肺氣腫所致的支氣管痙攣[1-2].因其會殘留聚集在動物可食用組織中,食用含沙丁胺醇的肉將會對人的肝、腎等內(nèi)臟器官產(chǎn)生毒副作用[3-4].目前已報道的沙丁胺醇的檢測方法有:毛細管電泳法[5-6]、比色法[7-8]、分光光度法[9-10]、免疫測定法[11-12]、結(jié)合反向流動注射微流控的安培法[13]、熒光光譜法和電致化學(xué)發(fā)光法[14-15].然而,這些方法大多都存在費時、靈敏度低、高成本和復(fù)雜的預(yù)處理過程等不足.

分子印跡技術(shù)是近年興起的具有高度識別性和選擇性材料的新技術(shù).由于分子印跡聚合物能夠高效地從復(fù)雜樣品中分離富集目標(biāo)分子,清除基體干擾,從而降低檢出限,提高分析的精度和準(zhǔn)確性,在傳感器研究中備受關(guān)注.本文中采用電化學(xué)聚合方法,成功制備了沙丁胺醇印跡的聚對氨基苯硫酚/納米金電化學(xué)傳感器.帶負電的金納米粒子和帶正電且有巰基的功能單體的使用,使該分子印跡聚合物更緊密的覆著在電極表面.該印跡電極選擇性良好,可用于豬飼料中沙丁胺醇的定量檢測.

1 實驗部分

1.1儀器與試劑電化學(xué)工作站CHI 660C(上海辰華儀器公司,中國上海);三電極系統(tǒng):裸玻碳電極(GCE直徑為3 mm)或經(jīng)修飾的玻碳電極為工作電極,飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極,鉑電極為對電極;超聲波清洗儀(BRANSON2000,美國);320-S酸度計(METTLER-TOLEDO,瑞士);掃描電子顯微鏡(JSM-5510 LV,日本).

對氨基苯硫酚(ATP)購自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司,沙丁胺醇(SAL)、克倫特羅和特布他林均購自中國藥品生物制品研究所,氯金酸(HAuCl4)和檸檬酸三鈉購自美國sigma公司.其他試劑均為分析純.實驗用水為去離子水.

1.2納米金的制備金納米粒子(AuNPs)參照文獻[16-17]以檸檬酸三鈉還原法合成.制備過程如下:所有玻璃器皿均先用王水(濃HCl+濃HNO3,V/V=3∶1)清洗干凈,然后用二次水沖洗,最后置于烘箱里面烘干待用.向250 mL圓底燒瓶中加入100 mL 0.01% HAuCl4水溶液,加熱至沸騰并劇烈攪拌,接著迅速加入3.0 mL 1%檸檬酸三鈉溶液.上述溶液在20 s內(nèi)迅速變?yōu)樯钏{色,然后在60 s后最終變成酒紅色.待溶液加熱沸騰40 min后停止加熱,繼續(xù)攪拌至膠體金溶液冷卻為室溫.制得的納米金平均粒徑為20～30 nm,溶液置于深色容器中4 ℃低溫保存.

1.3分子印跡傳感膜的制備玻碳電極(φ=3 mm)經(jīng)0.05 μm的α-Al2O3拋光布上拋光成鏡面,依次用二次水、乙醇、二次水充分超聲震蕩清洗.取30 μL制備好的納米金膠溶液滴涂于處理后的潔凈GCE上,在空氣中放置4 h,得到AuNPs/GCE.然后將AuNPs/GCE置于含0.1 mmol/L ATP和0.5 mmol/L SAL的HAc-NaAc(ABS,pH 5.2)水溶液中,于-0.2～+0.6 V電位范圍內(nèi),0.05 V/s掃速下循環(huán)掃描20圈,即制備得到嵌入SAL的PATP/AuNPs膜電極(SAL-PATP/AuNPs/GCE).電聚合完成后,將所得電極置于0.1 mol/L鹽酸-乙醇(1∶1,V∶V)混合溶液中洗滌至模板分子完全被除掉,得到保留有SAL構(gòu)型空穴的PATP/AuNPs分子印跡膜電極(imprinted PATP/AuNPs/GCE).在同樣的實驗條件下,底液中不加模板SAL分子,制備非印跡膜電極(non-imprinted PATP/AuNPs/GCE)作比較.

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡膜電極的表征

2.1.1 分子印跡膜電極的表面形貌表征 圖1是納米金修飾電極(AuNPs/GCE)、印跡電極(SAL-PATP/AuNPs/GCE)和非印跡電極(non-imprinted PATP/AuNPs/GCE)的掃描電鏡表征圖.如圖1(a)所示,金納米粒子均勻地分布在玻碳電極表面,粒徑約為30～50 nm.經(jīng)過電聚合過程后的印跡電極SAL-PATP/AuNPs/GCE(圖1(b)),金納米粒子明顯被一層膜所覆蓋,仍有少量顯露在膜外面,這說明沙丁胺醇印跡的聚合物層成功地連接到了AuNPs/GCE上.相反地,非印跡電極表面(圖1(c)),AuNPs幾乎完全被聚合物膜覆蓋了.這是聚合過程中,相對于分子印跡膜電極,非印跡膜的聚合過程沒有模板分子阻礙聚合物鏈的增長,其聚合度相對較大,聚合膜相對較厚、較緊致[19]的原因.

2.1.2 分子印跡膜電極的電化學(xué)表征 以鐵氰化鉀為電化學(xué)探針,采用循環(huán)伏安法對印跡電極的印跡過程進行表征,結(jié)果如圖2,裸玻碳電極在鐵氰化鉀溶液中出現(xiàn)一對可逆的氧化還原峰(圖2(a)),而對于納米金修飾電極(圖2(b)),峰電流有了顯著增強,這是因為電極表面修飾了金納米粒子以后,其比表面積大大增加.對于印跡電極(圖2(c)),由于聚合生成的膜比較平整,阻礙了[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面的氧化還原反應(yīng),故峰電流較小.從圖2(d)可以看出,非印跡電極的響應(yīng)電流最小,這可能是由于非印跡聚合膜相對于印跡膜而言更緊致、更厚,因此成為探針分子[Fe(CN)6]3-/4-向電極表面擴散的阻礙.

圖1 (a)AuNPs/GCE,(b)SAL-PATP/AuNPs/GCE,(c)non-imprinted PATP/AuNPs/GCE的掃描電鏡圖

電化學(xué)交流阻抗技術(shù)是研究電極過程動力學(xué)及界面現(xiàn)象的重要手段.在交流阻抗圖譜中,高頻和低頻兩個區(qū)域可用來描述電極表面法拉第阻抗的變化.其中,直線狀的低頻區(qū)域?qū)?yīng)于擴散過程,而我們更感興趣的頻區(qū)是半圓形的高頻區(qū)域,此區(qū)域電極反應(yīng)對應(yīng)于純動力學(xué)控制,相應(yīng)的異相電子傳遞電阻因為電極表面的阻礙作用而變大,半圓的直徑等于與電極/電解質(zhì)界面絕緣性有關(guān)的電子傳質(zhì)電阻.

圖3為不同修飾電極在5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的交流阻抗圖.由圖3可知,未洗脫的印跡電極(圖3(a))的半圓相對較大(Rct約為12 000 Ω).而洗脫模板分子之后,電極的Rct(約為4 000 Ω)值急劇減小(圖3(b)),說明印跡孔穴已經(jīng)形成.當(dāng)imprinted PATP/AuNPs/GCE在SAL溶液中培養(yǎng)一定時間后,Rct值又增大(c),說明印跡空穴與模板分子相互作用[18],一定量的SAL填補了imprinted PATP/AuNPs/GCE上膜的孔穴,使鐵氰化鉀的傳質(zhì)速率降低.圖3插圖所示為不同修飾電極的相應(yīng)的循環(huán)伏安行為,其變化趨勢與交流阻抗圖是一致的.

2.2培養(yǎng)時間對imprintedPATP/AuNPs/GCE的影響培養(yǎng)過程是一個能有效地提高印跡電極靈敏度的步驟.圖4為印跡電極培養(yǎng)時間與鐵氰化鉀峰電流響應(yīng)關(guān)系曲線.實驗過程如下:首先將imprinted PATP/AuNPs/GCE浸入到5.0×10-8mol/L SAL標(biāo)準(zhǔn)溶液中培養(yǎng)不同的時間,然后用超純水清洗電極1 min,再將印跡電極置于5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中進行循環(huán)伏安定量測定電流響應(yīng)值.由圖可知,鐵氰化鉀的峰電流隨培養(yǎng)時間的增長先快速減小,當(dāng)培養(yǎng)時間達到12 min后,峰電流的值變化緩慢,基本維持穩(wěn)定,說明達到印跡平衡.因此,選擇12 min作為印跡最佳培養(yǎng)時間.

圖2 電極(a)GCE、(b)GNPs/GCE、(c)SAL-PATP/GNPs/GCE和(d)non-imprinted PATP/GNPs/GCE在5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-探針溶液中的循環(huán)伏安曲線.掃速(0.1 V/s)

圖3 修飾電極(a)SAL-PATP/GNPs/GCE、(b)imprinted PATP/GNPs/GCE和(c)imprinted PATP/GNPs/GCE after incubation in 5.0×10-8 mol/L SAL在5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-探針溶液中的交流阻抗譜圖(插圖為各修飾電極相對應(yīng)的循環(huán)伏安曲線)

2.3阻抗測定圖5為imprinted PATP/AuNPs/GCE在不同濃度的SAL溶液中培養(yǎng)12 min,超純水清洗后,在5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的交流阻抗疊加圖譜.由圖可知,培養(yǎng)后印跡電極的Rct值隨SAL的濃度的增大而增大.圖5插圖為印跡膜和非印跡膜的校準(zhǔn)曲線.實驗表明:培養(yǎng)后印跡電極的Rct值與SAL濃度在6.2×10-9～2.4×10-7mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖5插圖線性曲線),線性回歸方程為:Z′/ohm=6 058+2.79C,線性相關(guān)性系數(shù)為0.999,檢測限為3.1×10-9mol/L(S/N=3).對non-imprinted PATP/AuNPs/GCE采取同樣的測定過程,培養(yǎng)后non-imprinted PATP/AuNPs/GCE的Rct值與濃度不呈線性關(guān)系(圖5插圖散點),且很快呈吸附飽和狀態(tài),這與non-imprinted PATP/AuNPs/GCE上聚合膜相對較厚和缺乏與SAL特異性結(jié)合位點有關(guān).

2.4傳感器選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性對濃度為5.0×10-8mol/L的SAL溶液進行干擾試驗,在有干擾物質(zhì)存在的情況下,SAL的檢測電流相對誤差超過5%視為存在干擾.實驗結(jié)果如圖6所示,結(jié)構(gòu)與SAL最接近的腎上腺素、特布他林和克倫特羅最高不干擾濃度為其200倍;多巴胺、尿酸和葡萄糖對SAL的最高干擾濃度為500～1 000倍;而抗壞血酸的最高干擾濃度僅為50倍,這可能是由于其分子較小,很容易進入imprinted PATP/AuNPs/GCE的孔穴而阻止電化學(xué)探針分子的電子傳遞.這種良好的選擇性取決于印跡膜中存在與SAL分子大小相匹配的孔穴以及印跡膜與SAL間特異性的結(jié)合.

圖4 峰電流隨培養(yǎng)時間的影響

圖5 峰電流隨沙丁胺醇濃度的影響

圖6 干擾物質(zhì)對沙丁胺醇檢測結(jié)果的影響

采用交流阻抗法研究了imprinted PATP/AuNPs/GCE重現(xiàn)性和穩(wěn)定性.用同一支印跡傳感器在濃度為5.0×10-8mol/L的SAL溶液中培養(yǎng)12 min,二次水沖洗后進行實驗,連續(xù)重復(fù)5次培養(yǎng)、測定、洗脫過程,其峰電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%,采用5支不同的修飾電極對5.0×10-8mol/L的SAL溶液進行測定,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%.此外,電極重復(fù)50次培養(yǎng)、測定、洗脫過程,對同濃度的SAL溶液的阻抗響應(yīng)值幾乎保持不變.上述實驗結(jié)果表明,該印跡電極具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性.

2.5實際樣品檢測為探究此傳感器的實際應(yīng)用能力,我們將此膜傳感器用于豬飼料中SAL含量的測定.豬飼料的處理過程如下:稱取1.0 g豬飼料加入到20 mL的離心管中,再加入10 mL新制備的磷酸-甲醇萃取液,超聲0.5 h后,離心(10 000 r/min)2 min,取上層清液進行分析.加標(biāo)回收實驗結(jié)果如表1所示,回收率為95.1%～103.8%.實驗結(jié)果表明該方法所測結(jié)果準(zhǔn)確,可用于SAL實際樣品的測定.

表1 豬飼料樣品的加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

綜合利用電聚合方法的優(yōu)點和PATP與AuNPs之間的相互作用,制備了沙丁胺醇印跡膜傳感器.該修飾電極用于豬飼料中沙丁胺醇含量的測定,方法簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好,具有潛在的應(yīng)用前景.

[1] Spyridaki M H, Kiousi P, Vonaparti A, et al. Doping control analysis in human urine by liquid chromatography-electrospray ionization ion trap mass spectrometry for the Olympic Games Athens 2004: determination of corticosteroids and quantification of ephedrines, salbutamol and morphine[J]. Anal Chim Acta,2006,573(1):242-249.

[2] Goyal R N, Oyama M, Singh S P. Fast determination of salbutamol, abused by athletes for doping, in pharmaceuticals and human biological fluids by square wave voltammetry[J]. J Electroanal Chem,2007,611(1/2):140-148.

[3] Ganjali M R, Norouzi P, Ghorbani M, et al. Fourier transform cyclic voltammetric technique for monitoring ultratrace amounts of salbutamol at gold ultra microelectrode in flowing solutions[J]. Talanta,2005,66(5):1225-1233.

[4] Ouyang J, Duan J L, Baeyens W R G, et al. A simple method for the study of salbutamol pharmacokinetics by ion chromatography with direct conductivity detection[J]. Talanta,2005,65(1):1-6.

[5] Sirichai S, Khanatharana P. Rapid analysis of clenbuterol, salbutamol, procaterol, and fenoterol in pharmaceuticals and human urine by capillary electrophoresis[J]. Talanta,2008,76(5):1194-1198.

[6] Esquisabel A, Herandez R M, Gascon A R, et al. Determination of salbutamol enantiomers by high performance capillary electrophoresis and its application to dissolution assays[J]. J Pharm Biomed Anal,1997,16(2):357-366.

[7] Lau J H W, Khoo C S, Murby J E. Determination of clenbuterol, salbutamol, and cimaterol in bovine retina by electrospray ionization-liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J AOAC Int,2004,87(1):31-38.

[8] Saleh M, Koh Y M, Tan S C, et al. Detection and determination of salbutamol in human urine and serum[J]. Analyst,2000,125(9):1569-1572.

[9] El-Enany N, Belal E, Rizk M. A simple kinetic spectrophotometric method for the determination of salbutamol in the dosage forms[J]. Chem Anal,2004,49(4):587-599.

[10] Basavaiah K, Prameela H C. Three useful bromimetric methods for the determination of salbutamol sulfate[J]. Anal Bioanal Chem,2003,376(6):879-883.

[11] Sheu S Y, Lei Y C, Tai Y T, et al. Screening of salbutamol residues in swine meat and animal feed by an enzyme immunoassay in Taiwan[J]. Anal Chim Acta,2009,654(2):148-153.

[12] Ventura R, González G, Smeyers M T, et al. Screening procedure forβ-adrenergic drugs in sports drug testing by immunological methods[J]. J Anal Toxicol,1998,22(2):127-134.

[13] Karuwan C, Wisitsorraat A, Maturos T, et al. Flow injection based microfluidic device with carbon nanotube electrode for rapid salbutamol detection[J]. Talanta,2009,79(4):995-1000.

[14] 秦永平,鄒遠高,梁茂值,等.柱切換-熒光檢測反相高效液相色譜法測定血漿中特布他林濃度[J].分析化學(xué),2004,32(9):1216-1218.

[15] Loss II J R, Orzechowski R F, Hock R S. Measurement of albuterol in guinea pig serum by high performance liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Biomed Chromatogr,2000,14(1):1-5.

[16] Grabar, K C, Freeman, R G, Hommer M B, et al. Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers[J]. Anal Chem,1995,67(4):735-743.

[17] Frens G. Controlled nucleation for regulation of particle-size in monodisperse gold suspensions[J]. Nat Phys Sci,1973,241(1):20-22.

[18] Zhang Z H, Hua Y F, Zhang H B, et al. Novel layer-by-layer assembly molecularlyimprinted sol-gel sensor for selective recognition of clindamycin based on Au electrode decorated by multi-wall carbon nanotube[J]. J Colloid Interface Sci,2010,344(1):158-164.

[19] Caballero A G, Ugarte A, Ortega A S, et al. Molecularly imprinted poly[tetra(o-aminophenyl)porphyrin] as a stable and selective coating for the development of voltammetric sensors[J]. J Electroanal Chem,2010,638(2):246-253.