模擬高原訓(xùn)練對(duì)大鼠紅細(xì)胞的影響及小麥肽的干預(yù)作用

劉霞 唐波，2 金愛娜 潘興昌 金其貫 蔡木易

1 揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院（揚(yáng)州225009）

2 廣東省中山市特殊教育學(xué)校 3中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院

高原訓(xùn)練中，機(jī)體承受高原缺氧和運(yùn)動(dòng)雙重刺激，促紅細(xì)胞生成素（EPO）分泌和紅細(xì)胞（RBC）生成增加，血液運(yùn)氧能力和機(jī)體有氧運(yùn)動(dòng)能力均提高［1］。但Biselli研究認(rèn)為，在高原訓(xùn)練中，由于缺氧和訓(xùn)練導(dǎo)致產(chǎn)生高濃度毒性羥基，引起紅細(xì)胞破壞，使游離鐵增加［2］，表明高原訓(xùn)練顯著增加機(jī)體氧化應(yīng)激，損傷能量代謝和細(xì)胞膜完整性。因此，采取有效措施減少紅細(xì)胞氧化損傷對(duì)提高高原訓(xùn)練效果有重要作用。小麥肽是以小麥蛋白為原料經(jīng)過特定微生物發(fā)酵或特定蛋白酶水解，分離制得的有多種生物活性的活性肽，具有抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、改善脂質(zhì)代謝、抗肥胖、抑制膽固醇等作用［3-9］。而在高原訓(xùn)練中補(bǔ)充小麥肽對(duì)紅細(xì)胞影響的研究尚未見報(bào)道。本研究通過觀察模擬高原環(huán)境及補(bǔ)充小麥肽對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠血細(xì)胞（Red blood cell，RBC）數(shù)量、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）含量、紅細(xì)胞壓積（hematocrit，Hct），紅細(xì)胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，血液丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）含量及油鏡下紅細(xì)胞形態(tài)的影響，探討高原環(huán)境和/或小麥肽補(bǔ)充對(duì)大鼠紅細(xì)胞的作用及其機(jī)制，為高原訓(xùn)練研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，6周齡，體重160～180 g，購(gòu)于購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)Scxk（浙）20080033，質(zhì)量合格證號(hào)0016507。飼養(yǎng)溫度（20±2）℃，自然光照，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，每天更換一次墊料，保持籠內(nèi)干燥。隨機(jī)分成正常對(duì)照組（C組，n=10）、高原對(duì)照組（HC組，n=10）、常氧訓(xùn)練組（E組，n=10）、高原訓(xùn)練組（HE組，n=10）和高原訓(xùn)練+小麥肽組（HEW組，n=10）。本實(shí)驗(yàn)在揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 模擬高原訓(xùn)練和補(bǔ)充方案

大鼠采用無負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)，每周6天，每天下午訓(xùn)練，游泳時(shí)間從30 min開始，2周內(nèi)逐漸增加到90 min。游泳池為100 cm×70 cm×60 cm長(zhǎng)方體，水深50 cm，水溫（32±1）℃。由 The MAG-10 Mountain Air Generator產(chǎn)生低氧條件，從模擬海拔1600 m開始，2周逐漸提高到3000 m，氧濃度為14.2%，正式訓(xùn)練9周。運(yùn)動(dòng)時(shí)注意觀察大鼠狀態(tài)，防止溺水死亡；及時(shí)撈出老鼠糞便，保持游泳池清潔。實(shí)驗(yàn)中由于操作不當(dāng)，E組有2只大鼠溺亡。每次訓(xùn)練后HEW組按500 mg/kg體重劑量灌服新鮮配制的小麥肽溶液，小麥肽由中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院（北京中食海氏生物技術(shù)有限公司）提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)取材

末次訓(xùn)練后，禁食12 h。第二天早晨依次稱重，按50 mg/kg劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠。從腹主動(dòng)脈取血約10 ml，先采用手工推片法制作血涂片，后將血液分成3份，1份注入血常規(guī)試管，2 h內(nèi)測(cè)定血常規(guī)；1份加入肝素抗凝管備測(cè)紅細(xì)胞SOD和GSH-Px活性；1份注入真空無菌試管，4℃、3000 r/min離心10 min分離血清，備測(cè)血清EPO和MDA含量。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

采用UnicelDXC800 Beckman Coulter血液分析儀測(cè)試血常規(guī)指標(biāo)。采用ELISA測(cè)定血清EPO，試劑盒購(gòu)于上海朗頓生物科技有限公司，測(cè)定儀器為ELX800型酶標(biāo)儀。采用羥胺法測(cè)定紅細(xì)胞SOD，采用硫代巴比妥酸法（TBA）測(cè)定血清MDA，采用比色法測(cè)定紅細(xì)胞GSH-Px，試劑盒購(gòu)于南京建成生物研究所，測(cè)試儀器為722型紫外分光光度計(jì)。在血涂片上滴1至2滴瑞氏-姬母薩復(fù)合染液A液，5分鐘后滴幾滴B液覆蓋，干燥后在油鏡下拍片，連續(xù)觀察1000個(gè)紅細(xì)胞的形態(tài)，計(jì)算畸形RBC數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示。C組、HC組、E組和HE組之間采用雙因素方差分析，HE組和HEW組之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示為顯著性差異，P<0.01表示為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 血液RRBBCC數(shù)量、HHbb、HHCCTT含量

從表1可見，長(zhǎng)期低氧暴露使大鼠RBC數(shù)量、Hb和HCT顯著升高（P<0.05），運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠RBC數(shù)量、Hb和HCT均無顯著影響，低氧環(huán)境和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)RBC數(shù)量、Hb和HCT改變無顯著交互作用。與HE組相比，HEW組RBC數(shù)量顯著增加（P<0.05）。

表1 各組大鼠血液RBC數(shù)量、Hb、HCT含量比較

2.2 血清EPO含量

由表2可知，長(zhǎng)期低氧暴露使大鼠血清EPO含量顯著降低（P<0.05），運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)血清EPO含量無顯著影響，低氧環(huán)境和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)血清EPO含量無顯著交互作用。與HE組相比，HEW組血清EPO含量顯著增加（P<0.05）。

2.3 紅細(xì)胞畸形率

在油鏡下，正常紅細(xì)胞為輕度雙凹盤狀，中央部分淡染，表面光滑規(guī)整。此外，還可見到以下幾種異形紅細(xì)胞（圖1）。（1）碎片紅細(xì)胞（＆），紅細(xì)胞呈碎片狀，無任何規(guī)則，大小不一；（2）口型紅細(xì)胞（＊），紅細(xì)胞外形呈現(xiàn)出口的形狀；（3）淚滴狀紅細(xì)胞（*），紅細(xì)胞外形像淚滴或者是梨形；（4）棘型紅細(xì)胞（#），紅細(xì)胞呈盤形，但邊緣不規(guī)整，呈剌狀或棘狀突起等。雙因素方差分析結(jié)果（表3）顯示，長(zhǎng)期低氧暴露使大鼠血液紅細(xì)胞畸形率降低，但無顯著性差異，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使血液紅細(xì)胞畸形率顯著升高（P<0.05），低氧和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)血液紅細(xì)胞畸形率升高有顯著交互作用（P<0.01）。另外，HEW組血液紅細(xì)胞畸形率顯著低于HE組。

表2 各組大鼠血清EPO含量比較

表3 各組大鼠紅細(xì)胞畸形率比較

2.4 紅細(xì)胞SOD、GSH-Px活性及血清MDA含量

從表4可見，長(zhǎng)期低氧暴露和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)紅細(xì)胞SOD、GSH-Px活性和MDA含量無顯著影響，而低氧和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)降低紅細(xì)胞SOD和GSH-Px活性和升高M(jìn)DA含量有顯著交互作用（P<0.05）。與HE組相比，HEW組紅細(xì)胞SOD活性顯著升高（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.01），而GSH-Px活性有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 各組大鼠紅細(xì)胞SOD、GSH-Px活性和血清MDA含量比較

3 討論

研究證實(shí)，不同模式低氧訓(xùn)練，包括傳統(tǒng)高原訓(xùn)練能有效增加血液RBC數(shù)量和Hb含量［10-13］。而高原訓(xùn)練中，低氧和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練兩個(gè)因素的交互作用不完全清楚。Wolfel等［14］認(rèn)為，即使非運(yùn)動(dòng)員在高原停留3～4周不進(jìn)行訓(xùn)練，RBC數(shù)量也會(huì)升高。然而，馮連世等［15］研究發(fā)現(xiàn)，與高原安靜相比，高原訓(xùn)練更能促進(jìn)RBC生成。在中等海拔高度訓(xùn)練組RBC較久居高原安靜組明顯增加，表明缺氧和運(yùn)動(dòng)兩種刺激分別起作用，紅細(xì)胞生成促進(jìn)不僅與缺氧程度有關(guān)［15］。本研究采用交互設(shè)計(jì)方案，通過雙因素方差分析，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期低氧暴露使大鼠RBC數(shù)量、Hb和HCT顯著升高，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使大鼠RBC數(shù)量、Hb和HCT有所降低，但無顯著性差異，而低氧環(huán)境和運(yùn)動(dòng)對(duì)RBC數(shù)量、Hb和HCT改變無顯著交互作用，表明低氧暴露是促進(jìn)血液紅細(xì)胞數(shù)量、Hb含量和HCT增加的主要因素。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，低氧聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練不僅未引起血液RBC數(shù)量、Hb含量和HCT進(jìn)一步升高，而且與HC組相比，RBC數(shù)量、Hb含量和HCT均有降低趨勢(shì)。在某種程度上可以說明在低氧環(huán)境中進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)低氧促進(jìn)血液RBC數(shù)量增多和Hb含量增加起到一定的抑制作用。

血液RBC數(shù)量取決于RBC生成和破壞的平衡。EPO是促進(jìn)紅細(xì)胞生成的非常重要的因素之一。但維持高水平EPO并不是RBC持續(xù)增加所必需的［16］。研究認(rèn)為，世居平原運(yùn)動(dòng)員到高原訓(xùn)練3～4天后，血清EPO濃度迅速增高，而隨著Hb和Hct上升，EPO濃度反而下降［17，18］。因此，低氧環(huán)境時(shí)引起EPO濃度變化的原因不是缺氧而是氧濃度［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期低氧暴露使大鼠血清EPO含量顯著降低，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)血清EPO含量無顯著影響，低氧和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)血清EPO含量無顯著交互作用。其原因可能是長(zhǎng)期低氧使血液RBC數(shù)量和Hb含量顯著增加，反饋性抑制了EPO分泌，導(dǎo)致血液EPO含量減少。

有研究證實(shí)，機(jī)體進(jìn)行大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，血乳酸增加、氧自由基生成增多，血流加快使紅細(xì)胞之間及紅細(xì)胞與血管壁之間的機(jī)械摩擦增多，常常引起血液RBC破壞增多，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性貧血［20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期低氧暴露使大鼠血液紅細(xì)胞畸形率降低，但無顯著性差異，而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使血液紅細(xì)胞畸形率顯著升高，低氧和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)升高血液紅細(xì)胞畸形率有顯著交互作用。這表明長(zhǎng)期低氧暴露對(duì)血液紅細(xì)胞畸形率無顯著影響，而常氧下運(yùn)動(dòng)和高原訓(xùn)練均可明顯增加血液紅細(xì)胞畸形率，導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞增多，引起紅細(xì)胞數(shù)量減少和Hb含量降低。本研究還發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期低氧暴露和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使紅細(xì)胞SOD和GSH-Px活性有增加趨勢(shì)，MDA含量有降低趨勢(shì)，但均無顯著性差異，而低氧環(huán)境和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)降低紅細(xì)胞SOD和GSH-Px活性和升高M(jìn)DA含量有顯著交互作用，從而說明低氧暴露或常氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練雖然對(duì)血液氧自由基代謝無顯著影響，但在低氧環(huán)境中進(jìn)行同樣負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使機(jī)體的氧化應(yīng)激增強(qiáng)，從而產(chǎn)生大量氧自由基。這與前人的研究結(jié)果相同［21-24］。因此，在低氧環(huán)境下運(yùn)動(dòng)，大鼠機(jī)體氧自由基含量升高，SOD和GSHPx活性降低，MDA含量升高，自由基對(duì)紅細(xì)胞膜的破壞增多，同時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)細(xì)胞之間的碰撞和紅細(xì)胞與血管的沖撞，導(dǎo)致紅細(xì)胞損傷加重，紅細(xì)胞畸形率大幅度升高，紅細(xì)胞數(shù)量有限減少，血紅蛋白濃度降低。因此，在高原訓(xùn)練過程采取有效措施干預(yù)氧自由基生成，維持紅細(xì)胞正常形態(tài)和功能，對(duì)提高訓(xùn)練效果有重要意義。

研究表明，小麥肽有很強(qiáng)的抗氧化性，能顯著提高組織SOD活性，同時(shí)顯著降低MDA含量［4-8］。殷微微等［9］推測(cè)小麥肽的抗氧化活性可能通過以下途徑起作用：（1）作用于脂質(zhì)過氧化物，打斷其惡性循環(huán)連鎖反應(yīng)，抑制膜結(jié)構(gòu)上不飽和脂肪酸的過氧化；（2）酶解物中活性肽或游離氨基酸通過復(fù)雜的代謝途徑，激活內(nèi)源性SOD和GSH-Px，并提高其活性［9］。本研究讓大鼠在模擬海拔3000 m的低氧艙中進(jìn)行9周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，每天定時(shí)補(bǔ)充小麥肽。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HE組相比，HEW組RBC數(shù)量、血清EPO含量顯著增加，血液紅細(xì)胞畸形率顯著降低。同時(shí)，HEW組紅細(xì)胞SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低，而GSH-Px活性有升高趨勢(shì)，但無顯著性差異。這表明高原訓(xùn)練時(shí)補(bǔ)充小麥肽一方面提高EPO分泌，促進(jìn)RBC生成，另一方面顯著抑制氧自由基生成，對(duì)減輕RBC過氧化損傷，維持其正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能有重要作用。

4 總結(jié)

4.1 高原訓(xùn)練提高大鼠RBC數(shù)量、Hb含量和HCT，低氧因素起決定性作用。

4.2 在低氧環(huán)境中進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使紅細(xì)胞抗氧化作用降低，氧自由基生成增加，導(dǎo)致紅細(xì)胞畸形率顯著增多，影響高原訓(xùn)練效果。

4.3 小麥肽顯著抑制高原訓(xùn)練大鼠氧自由基生成，對(duì)減輕高原訓(xùn)練大鼠RBC過氧化損傷，維持RBC正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能有重要作用。

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