一次急性力竭運(yùn)動后大鼠肝T W SG 1、BM P6、SM A D 4 mRNA及肝非血紅素鐵的時(shí)相性變化

王羽 王海濤 王金霞 宋文靖 劉玉倩

河北師范大學(xué)體育學(xué)院（石家莊050024）

扭轉(zhuǎn)原腸胚形成同系物1（Twisted gastrulation，TWSG1）是近年發(fā)現(xiàn)的在維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用的鐵調(diào)控蛋白。TWSG1主要通過抑制腸鐵吸收的負(fù)調(diào)控蛋白肝鐵調(diào)素（hepcidin）表達(dá)而改變機(jī)體鐵狀態(tài)［1］。其調(diào)控通路主要通過抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）表達(dá)［2］，再通過BMP和SMAD4（drosophila mothers against decapentaplegic protein）影響hepcidin合成與分泌。Hepcidin可降低腸鐵吸收和巨噬細(xì)胞鐵釋放，調(diào)控機(jī)體鐵狀態(tài)［3］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動往往引發(fā)低鐵狀態(tài)，這與肝hepcidin分泌增加密切相關(guān)［4，5］。關(guān)于一次急性力竭運(yùn)動后恢復(fù)過程中的鐵調(diào)控機(jī)制及TWSG1的調(diào)節(jié)作用目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠一次急性力竭運(yùn)動及其恢復(fù)不同時(shí)期TWSG1、BMP6、SMAD4 mRNA表達(dá)和肝非血紅素鐵的變化，探討急性運(yùn)動對鐵代謝的調(diào)控作用，為促進(jìn)機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)恢復(fù)，防止運(yùn)動性鐵缺乏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性SD大鼠30只，體重（220±10）g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物養(yǎng)殖中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2008-1-003。使用國家標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)嚙齒類動物干飼料喂養(yǎng)，自由飲水，自然光照，環(huán)境溫度20～25℃，相對濕度40%～50%。隨即分為對照組（CG組）6只和運(yùn)動組（EG組）24只。本實(shí)驗(yàn)在河北師范大學(xué)鐵代謝分子生物學(xué)研究室進(jìn)行。

1.2 訓(xùn)練方式

對照組不運(yùn)動。運(yùn)動組先在跑臺上適應(yīng)性運(yùn)動3天，然后進(jìn)行正常實(shí)驗(yàn)。采用跑速30 m/min、坡度為0的一次大強(qiáng)度急性運(yùn)動直至力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn)：大鼠腹部成匍匐狀不能前進(jìn)。

1.3 取材

運(yùn)動組大鼠分為4組，分別在力竭運(yùn)動后即刻（E0h組）、3 h（E3h組）、6 h（E6h組）、24 h（E24h組）取材。用1%戊巴比妥納（1 ml/100g）麻醉大鼠，待大鼠無知覺后，剪開胸腔，使其心臟暴露，用注射器心尖取血，然后用滅活的DEPC水快速灌流，沖凈組織內(nèi)的血液。取肝組織中同一部位的樣品50～100 mg裝入EP管中，迅速投入液氮，以備做RNA測定。

1.4 RT-PCR 法檢測肝組織 TWSG1、BMP6、SMAD4 mRNA表達(dá)

cDNA合成：取約100 mg肝組織樣品，加入1 ml Trizol（Invitrogen，USA）（100 mg/1ml），在勻漿器中勻漿，磨碎后加入200 μl氯仿，使RNA溶解到氯仿中，震蕩后12000 g離心15 min。然后提取上清液加入異丙醇析出RNA沉淀，震蕩后12000 g離心10 min，沉淀后的RNA用75%乙醇清洗2遍，晾干加入滅活的DEPC水測定濃度。提取總RNA后開始PCR儀中反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行cDNA的合成。采用兩步法70℃、10 min，42℃、1h，75℃、15 m i n合成。

PCR 引物堿基序列參考 Tanno［1］和 Babitt等［6，7］的報(bào)道，由上海生工合成，內(nèi)參為β-actin［5］。PCR引物序列β-actin mRNA序列為上游引物5’-ggtcacccacactgtgcccatcta-3’，下游引物 5’-gaccgtcaggcagctcacatagctct-3’，TWSG1 mRNA 序列為上游引物 5’-agggggcgtggacattg-3’，下游引物5’-ctgtgtctccccgtgtcc-3’，BMP6 mRNA 序列為上游引物 5’-gtgtgggcctccgaagaa-3’，下游引物 5’-acactcagctggagtcccatgt-3’，SMAD4 mRNA序列為上游引物5’-caacatccaccaagtaatcgc-3’下游引物5’-ctctcaatagcttctgtcctg-3’。

1.5 肝非血紅素鐵測定

參照本實(shí)驗(yàn)室以往的實(shí)驗(yàn)方法［8］。取肝組織用去離子水沖洗后烘干，加入12.5倍體積混合酸，消化20 h。取0.025 ml上清液及鐵標(biāo)準(zhǔn)液（Sigma），加入染色劑（bDA，Sigma）1.25 ml，10 min后于540 nm波長測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，顯著性水平為P<0.05，非常顯著性水平為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 肝TWSG 1、BMP 6和SMAD 4 mRNA表達(dá)

圖1顯示，E3h組TWSG1 mRNA表達(dá)量顯著低于CG組和E24h組（P<0.01），E24h組顯著高于其它各組（P<0.01）。E3h組BMP6 mRNA表達(dá)顯著高于其它各組（P<0.01），E24h組顯著低于其它各組（P<0.01）。E3h組SMAD4 mRNA表達(dá)顯著高于其它各組（P<0.01），E24h組顯著高于CG組（P<0.01），但顯著低于E6h組（P<0.05）。

2.2 肝非血紅素鐵含量

E3h組肝非血紅素鐵顯著低于其它各組（P<0.01，P<0.05），E24h組顯著高于運(yùn)動后其它各組（P<0.01，P<0.05），但與CG組相比無明顯差異（P>0.05）（表1）。

圖1 一次急性力竭運(yùn)動后大鼠肝鐵代謝相關(guān)調(diào)控基因mRNA表達(dá)（n=6）

表1 一次急性力竭運(yùn)動后大鼠肝非血紅素鐵含量變化

3 討論

3.1 一次急性力竭運(yùn)動后肝TWSG1和BMP6及SMAD4 mRNA的時(shí)相性變化

2000年［9］和2001年［10］研究者在《Nature》發(fā)表論文，指出果蠅和蛙胚胎中的TWSG1通過抑制BMP途徑調(diào)控胚胎的生長發(fā)育。此后，關(guān)于TWSG1的研究主要集中在營養(yǎng)及胚胎的神經(jīng)、骨等的發(fā)育中［11，12］。直到隨著對鐵代謝中BMP調(diào)控通路的逐漸認(rèn)識［13］，發(fā)現(xiàn)TWSG1通過BMP抑制肝鐵調(diào)素（hepcidin）表達(dá)，影響機(jī)體鐵狀態(tài)，TWSG1與鐵代謝才引起學(xué)者關(guān)注［1］。進(jìn)一步研究表明，TWSG1主要通過下調(diào)BMP/SMAD信號通路而抑制hepcidin表達(dá)，維持機(jī)體鐵的動態(tài)平衡［14-17］。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠一次急性運(yùn)動后及不同恢復(fù)時(shí)間TWSG1表現(xiàn)出明顯的時(shí)相性變化，運(yùn)動后3h水平較低，而運(yùn)動后24h明顯增高。TWSG1是對hepcidin轉(zhuǎn)錄有抑制作用的基因。而促進(jìn)hepcidin轉(zhuǎn)錄的調(diào)控基因BMP6和SMAD4卻呈現(xiàn)相反變化趨勢，運(yùn)動后3h水平較高，運(yùn)動后24h明顯下降。這驗(yàn)證了以往研究的結(jié)論，TWSG1對BMP6和SMAD4信號通路起抑制作用，TWSG1、BMP6和SMAD4在急性運(yùn)動中參與調(diào)控機(jī)體鐵狀態(tài)。鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白（hemojuvelin，HJV）是位于細(xì)胞膜上的一種膜蛋白，在肝細(xì)胞、骨骼肌和心肌中均有表達(dá)［18］。BMP6在BMP輔助受體-鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白的參與下與BMP6受體結(jié)合，促進(jìn)位于細(xì)胞表面的SMAD1/5/8（轉(zhuǎn)化生長因子β家族成員配體）磷酸化［19，20］。這些激活的SMAD 可依次與SMAD4結(jié)合形成復(fù)合體，該復(fù)合體移動到細(xì)胞核調(diào)節(jié)hepcidin轉(zhuǎn)錄［21］。急性運(yùn)動后不同恢復(fù)時(shí)間的HJV表達(dá)變化還需進(jìn)一步研究。

3.2 大鼠一次急性力竭運(yùn)動后肝非血紅素鐵的動態(tài)變化

除了受TWSG1調(diào)控，BMP6還可感受機(jī)體鐵含量變化，通過鐵調(diào)素調(diào)節(jié)鐵代謝，維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)［22］。肝是機(jī)體重要的儲鐵器官，其中血紅素鐵是功能性鐵，非血紅素鐵主要是鐵蛋白、含鐵血黃素等儲存鐵［23］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，急性力竭運(yùn)動后即刻和運(yùn)動后3 h，肝非血紅素鐵顯著下降，說明機(jī)體運(yùn)動消耗大量鐵，為了維持鐵穩(wěn)態(tài)，釋放儲存鐵進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。運(yùn)動后24 h肝鐵儲存逐步恢復(fù)，這可能與肝細(xì)胞膜上的鐵攝入蛋白表達(dá)量升高有關(guān)；也可能與機(jī)體鐵消耗隨運(yùn)動停止而逐漸下降，肝鐵釋放減少；還可能是巨噬細(xì)胞儲存的鐵釋放及腸鐵吸收增加，增加循環(huán)系統(tǒng)鐵量等有關(guān)。其機(jī)制仍需研究。

本實(shí)驗(yàn)中，肝非血紅素鐵變化趨勢恰與TWSG1的時(shí)相性變化一致，推測可能是在運(yùn)動后初期，機(jī)體對運(yùn)動產(chǎn)生適應(yīng)性調(diào)節(jié)，肝貯存鐵被動員進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，增加了血液中的鐵含量。為了維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)，TWSG1表達(dá)下降，減少對BMP6和SMAD4的抑制，促進(jìn)hepcidin表達(dá)，而降低貯存鐵釋放和腸鐵吸收。隨著肝非血紅素鐵大量損耗，血清鐵也逐漸下降［23］，運(yùn)動后機(jī)體為了恢復(fù)肝鐵貯存量，TWSG1表達(dá)上升，抑制BMP6/SMAD4通路，降低hepcidin表達(dá)，促進(jìn)腸鐵吸收，維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)。運(yùn)動后24h，TWSG1表達(dá)水平仍較高，而BMP6/SMAD4表達(dá)較低，表明一次急性力竭運(yùn)動對機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的影響在運(yùn)動后24h時(shí)仍未完全恢復(fù)，如果此時(shí)繼續(xù)大強(qiáng)度運(yùn)動，可能造成機(jī)體鐵代謝紊亂，誘發(fā)運(yùn)動性鐵缺乏甚至運(yùn)動性貧血。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了這一點(diǎn)［4，5，24］。

此外，在血紅蛋白形成前紅細(xì)胞分化的早期階段，TWSG1表達(dá)較高［1］，說明TWSG1能更早反映鐵代謝變化。但能否考慮通過檢測血清TWSG1變化，及時(shí)調(diào)整運(yùn)動員訓(xùn)練計(jì)劃，防止出現(xiàn)鐵代謝紊亂，尚缺乏深入研究。

4 總結(jié)

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一次急性力竭運(yùn)動中TWSG1、BMP6及SMAD4通路對機(jī)體鐵狀態(tài)發(fā)揮重要調(diào)控作用，一次力竭性運(yùn)動對機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)有較大影響，如果長時(shí)間進(jìn)行大強(qiáng)度運(yùn)動而恢復(fù)時(shí)間不足，機(jī)體可能出現(xiàn)鐵代謝紊亂。

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