變性高效液相色譜法檢測(cè)晚期肺腺癌人類表皮生長(zhǎng)因子受體2突變的探索性研究

趙瑩瑩 盧紹禹 杜文 梁潔 楊艷華

肺癌是全球總體發(fā)病率最高的惡性腫瘤，并且長(zhǎng)期為首位的癌癥類致死疾病[1-2]。肺癌根據(jù)病理形態(tài)可以分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的85%左右，非小細(xì)胞肺癌又可以分為腺癌、鱗癌及大細(xì)胞癌。非小細(xì)胞肺癌大部分在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)為晚期病例從而失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，并且其5年生存率只有15%～16%。隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，肺鱗癌的發(fā)生率有所下降，肺腺癌的比率不斷上升，目前，已成為最常見(jiàn)的肺癌病理亞型。近年來(lái)，對(duì)于非小細(xì)胞肺癌尤其是肺腺癌的遺傳學(xué)研究闡明了部分肺癌的發(fā)病機(jī)理，即EGFR、KRAS、HER2、ALK等基因突變導(dǎo)致了肺腺癌的發(fā)生并維持其生長(zhǎng)[3-7]。針對(duì)特定驅(qū)動(dòng)突變的靶向藥物可以使腫瘤產(chǎn)生明顯的消退，并顯著延長(zhǎng)患者無(wú)疾病生存期，針對(duì)EGFR酪氨酸激酶域突變的小分子抑制劑吉非替尼和厄洛替尼取得了很好的臨床效果[3]。

人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）基因，即c-erbB-2基因，定位于染色體17q12-21.32上。HER2基因異常表達(dá)、拷貝數(shù)增加和體細(xì)胞突變常見(jiàn)于許多種人類腫瘤，例如乳腺癌中常見(jiàn)到HER2的蛋白高表達(dá)和拷貝數(shù)擴(kuò)增，這部分乳腺癌病例可能從單克隆抗體曲妥珠單抗治療中獲益[8]。前期的研究表明HER2基因構(gòu)成肺腺癌突變譜的一個(gè)亞型，約3.8%的肺腺癌有HER2基因酪氨酸激酶域的突變，其中絕大部分為20號(hào)外顯子YVMA非移碼插入突變[7-9]。由于晚期肺癌病例往往難以取得足夠的腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行基因測(cè)序診斷，如何有效地通過(guò)其他途徑檢測(cè)腫瘤體細(xì)胞突變是困擾腫瘤科醫(yī)生的難題。DHPLC技術(shù)是一種高通量篩選基因序列突變的方法，具有快速和高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)證明可以檢測(cè)到晚期肺癌患者血清中EGFR基因的突變[10]。本研究旨在探索DHPLC方法檢測(cè)晚期肺腺癌患者血清中HER2突變的效果，擴(kuò)展其應(yīng)用范圍。

1 資料與方法

1.1 一般資料 連續(xù)收集本院2006年9月-2010年5月收治的晚期肺癌患者血液樣本，經(jīng)外院已有病理診斷的晚期肺腺癌共52例。其中男31例，女21例，平均年齡（62.09±9.9）歲。其中吸煙者35例，不吸煙者17例；高分化、中分化和低分化肺腺癌分別占13.4%，50.0%和36.6%；Ⅲ期患者7例（13.4%），Ⅳ期患者45例（86.6%）。

1.2 DNA提取 采用QIAmp DNA Blood Mini kit進(jìn)行血清DNA抽提，操作根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟。

1.3 PCR擴(kuò)增 使用HER2基因20號(hào)外顯子前后內(nèi)含子引物對(duì)外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為5’-GCCATGGCTGTGGTTTGTGATGG-3’和5’-ATCCTAGCCCCTTGTGGACATAGG-3’。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s循環(huán) 36 次，72 ℃延伸10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增片段。

1.4 變性高效液相色譜分析 DHPLC檢測(cè)使用WAVE4500核酸片段分析系統(tǒng)（Transgenomic公司），試劑主要包括TEAA和乙腈。步驟主要包括：（1）緩慢變性，95 ℃變性5 min，然后以0.03 ℃/s速率緩慢復(fù)性至25 ℃，使雜合子形成異源雙鏈；（2）確定熔解溫度，根據(jù)溫度預(yù)測(cè)軟件對(duì)DNA片段進(jìn)行序列分析，確定熔解溫度；（3）取10 μl緩慢變性PCR產(chǎn)物上樣，分析流出峰峰形。

1.5 直接測(cè)序 對(duì)于DHPLC檢測(cè)出可疑突變的樣本，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠回收，樣本送商業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

筆者共對(duì)52例收集到的晚期肺腺癌患者血清樣本進(jìn)行了檢測(cè)。通過(guò)將野生型對(duì)照與檢測(cè)樣本1：5制成混合樣本上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，共篩選到了3個(gè)可疑混合樣本（圖1 c、e、g）。重復(fù)進(jìn)行的PCR直接測(cè)序?qū)梢傻臉颖具M(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)了混合樣本中各有一個(gè)樣本突變（圖1 d、f、h）。HER2基因20號(hào)外顯子的突變率為5.7%（3/52），所檢出的突變得到了直接測(cè)序驗(yàn)證，均為YVMA非移碼插入突變，未檢出其他突變類型。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌尤其是肺腺癌的分子靶向治療目前已經(jīng)成為肺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。以EGFR酪氨酸激酶域小分子靶向抑制劑吉非替尼（易瑞沙）和厄洛替尼（特羅凱）為代表的靶向藥物在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。尤其對(duì)于有EGFR酪氨酸激酶域（18-22號(hào)外顯子）激活突變的病例，應(yīng)用吉非替尼和厄洛替尼可以產(chǎn)生顯著延長(zhǎng)患者的無(wú)進(jìn)展生存期，其總體反應(yīng)率可以達(dá)到70%以上。通過(guò)對(duì)肺腺癌突變譜的研究發(fā)現(xiàn)，除了EGFR之外，還有KRAS、HER2、ALK、ROS1、RET等基因突變或融合導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。其中HER2突變是一種非常有靶向治療前景的亞型。HER2基因的異常常見(jiàn)于很多中人類惡性腫瘤中，包括乳腺癌中的蛋白高表達(dá)和基因擴(kuò)增，結(jié)直腸癌中的蛋白高表達(dá)，肺癌中的基因擴(kuò)增和酪氨酸激酶域激活突變。在HER2基因高表達(dá)和基因擴(kuò)增的病例，HER2單克隆抗體曲妥珠單抗（赫塞?。┲委熆梢匀〉幂^好的效果。前期的研究表明，HER2基因在肺腺癌中突變率為3%～4%，在其他亞型的肺癌中沒(méi)有報(bào)道，表明HER2突變代表了一個(gè)亞型的肺腺癌，有希望從針對(duì)HER2的靶向治療中獲益。

在晚期肺癌的基因靶向治療中，另一個(gè)影響準(zhǔn)確分子分型診斷和治療的因素是往往無(wú)法獲得足夠的腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行基因診斷。晚期肺癌患者基礎(chǔ)身體條件往往較差，患者及家屬可能不愿接受氣管鏡活檢甚至經(jīng)皮肺穿刺活檢。傳統(tǒng)的活檢一般以明確病理診斷為目的，難以獲取足夠多的組織再次進(jìn)行基因診斷。因此，探索通過(guò)其他標(biāo)本來(lái)檢測(cè)肺癌突變具有重要的臨床意義。由于近年來(lái)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器的進(jìn)步，通過(guò)外周血液中捕獲腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞崩解后釋放的基因片段，進(jìn)而利用高敏感度的檢測(cè)成為了現(xiàn)實(shí)。其中DHPLC技術(shù)因其具有高通量和超高敏感度的優(yōu)勢(shì)引起了研究人員的注意。在之前的研究中，研究人員已經(jīng)成功利用這一技術(shù)檢測(cè)了晚期肺癌患者外周血中EGFR基因的常見(jiàn)突變，并通過(guò)與對(duì)應(yīng)腫瘤組織的測(cè)序研究證實(shí)了這一技術(shù)路線的準(zhǔn)確性和可行性。在本研究中，筆者使用DHPLC技術(shù)對(duì)晚期肺腺癌患者外周血樣本進(jìn)行了檢測(cè)和驗(yàn)證，共發(fā)現(xiàn)了3例（5.7%）HER2 20號(hào)外顯子插入突變，并且得到了直接測(cè)序的驗(yàn)證。直接測(cè)序的驗(yàn)證中兩例突變峰較低（圖1 f、h），這一結(jié)果符合腫瘤細(xì)胞DNA含量較低的預(yù)期。

圖1 DHPLC檢測(cè)晚期肺腺癌患者血清HER2基因突變片段

總之，筆者的探索性實(shí)驗(yàn)研究表明，在晚期肺腺癌患者外周血液樣本中可以使用DHPLC技術(shù)檢測(cè)HER2基因的突變。通過(guò)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行質(zhì)量控制，這一方法可以準(zhǔn)確檢出基因突變，為晚期肺癌患者獲得基因診斷提供了新的檢測(cè)方法，使這部分患者有機(jī)會(huì)接受靶向治療并從中獲益。

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