不同痰標本處理方法對結(jié)核分枝桿菌羅氏培養(yǎng)檢測結(jié)果的影響

趙立平 朱瑪 姜廣路 于霞 黃海榮

目前，結(jié)核病仍然是全球范圍內(nèi)嚴重的公共衛(wèi)生問題之一［1］。據(jù) WHO統(tǒng)計，2002年世界1／3的人口已感染結(jié)核分枝桿菌［2］，據(jù)估算，每年約有200萬例患者死于結(jié)核?。?］。結(jié)核病的早期診斷和快速治療對疾病的控制至關(guān)重要，診斷的延誤必然導致病情惡化，并增加結(jié)核病傳播的風險［4］。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是結(jié)核病細菌學檢查的重要方法，被認為是診斷結(jié)核病的金標準。目前在我國各級結(jié)核病診斷實驗室中，基于羅氏培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)是最常用的培養(yǎng)方法之一。本研究分析采用簡單法和離心法處理痰標本，以及采用離心法處理痰標本時不同離心條件對羅氏培養(yǎng)檢測結(jié)果的影響，以尋求目前情況下最適合我國結(jié)核病實驗室操作的技術(shù)。

材料和方法

一、臨床標本的來源

選取2010年9月至2010年11月在北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所國家結(jié)核病臨床實驗室進行細菌學檢查的疑似結(jié)核病患者痰標本198份，其中顯微鏡檢查涂片陽性者99份，涂片陰性者99份；男143例，女55例。年齡范圍10～91歲，平均年齡（48．4±19．9）歲。

二、方法

1．儀器和試劑：恒溫培養(yǎng)箱（型號：SKP08B，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）；渦旋振蕩器（型號：vortex-2，Scientific Industries）；搖床 （型號：培英HZ-E，太倉市實驗設(shè)備廠）；離心機（型號：CR21GⅢ，HITACHI）；氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、谷氨酸鈉、枸櫞酸鎂均購自國藥集團化學試劑有限公司。

2．羅氏培養(yǎng)基的制備：酸性羅氏培養(yǎng)基和中性羅氏培養(yǎng)基的制備參見參考文獻［5］。

3．羅氏培養(yǎng)基簡單法培養(yǎng)：取1ml痰標本，加入1～1．5倍體積4%NaOH溶液進行消化，旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10～20s，振蕩混勻后室溫孵育15min。100μl處理后的樣品直接接種至酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上，每份標本平行接種2管酸性羅氏培養(yǎng)基。37℃溫箱培養(yǎng)8周，每周觀察記錄結(jié)果。

4．羅氏培養(yǎng)基離心法培養(yǎng)：取1ml痰標本，加入1～1．5倍體積 N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉（NaOH-NAC）混合溶液進行消化，旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10～20s，直至痰標本充分液化；將離心管室溫靜置15min；加入PBS中和至體積為40ml，分別采用5種不同的離心條件：①3000×g離心15min（一般常規(guī)所用離心條件）；②3000×g離心8min；③3000×g離心25min；④2000×g離心15min；⑤5000×g離心15min。100μl處理后的樣品分別接種至中性羅氏培養(yǎng)基斜面上。每份標本平行接種2管中性羅氏培養(yǎng)基。37℃溫箱培養(yǎng)至8周，每周觀察記錄結(jié)果。

5．結(jié)果判定：（1）初生長時間的判定：首次發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基斜面上有菌落生長的時間確定為初生長時間。（2）污染率的判定：以標本的份數(shù)為計算單位，同一份標本的2個接種管均污染時認為污染，若只有單只接種管污染則不認為污染。污染率＝污染份數(shù)／樣本數(shù)×100%。

6．質(zhì)量控制（簡稱“質(zhì)控”）：質(zhì)控菌株 H37Rv（ATCC 27294）為國家結(jié)核病臨床實驗室保存菌株，將生長至對數(shù)期的H37Rv菌株用生理鹽水比濁至0．5個麥氏濃度，取1ml比濁好的菌液，處理方法同痰標本，分別接種100μl至中性或酸性羅氏培養(yǎng)基。若質(zhì)控菌株培養(yǎng)結(jié)果為陽性，說明質(zhì)控合格，否則質(zhì)控結(jié)果不合格。

7．統(tǒng)計學分析：采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗進行分析，非正態(tài)分布的計量資料采用秩和檢驗進行分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1．不同處理方法的培養(yǎng)結(jié)果和污染率：任何一種方法培養(yǎng)陽性即認定標本培養(yǎng)陽性，198份痰標本中共有126份培養(yǎng)陽性，其中97份來自涂片陽性痰標本，29份來自涂片陰性痰標本。126份培養(yǎng)陽性的痰標本中，簡單法的培養(yǎng)陽性率93．65%（118／126），與一般常規(guī)所用離心條件（3000×g離心15min）培養(yǎng)陽性率96．03%（121／126）相比，兩者差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0．146，P＝0．702）。在125份離心法培養(yǎng)陽性的標本中，3000×g離心15min、3000×g離心8min、3000×g離心25min、2000×g離心15min、5000×g離心15min 5種不同離心條件下培養(yǎng)陽性率分 別 為 96．03%、89．68%、95．24%、92．06% 和96．03%（表1）。選取的198份痰標本中，簡單法總體污染率為3．03%（6／198），離心法3000×g離心15min的污染率為3．54%（7／198），兩者間差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0．074，P＝0．785）。

2．不同處理方法的培養(yǎng)結(jié)果初生長時間：由于6組不同處理方法的初生長時間數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布（Kolmogorov-Smirnow正態(tài)性檢驗結(jié)果，P值均＜0．05），故采用秩和檢驗來進行統(tǒng)計分析。6種不同處理方法初生長時間的差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝187．63，P＜0．001）。再進行組內(nèi)兩兩比較，將α值矯正為0．0033（0．05／15）。簡單法（118份陽性）與一般常規(guī)所用離心條件3000×g離心15min（121份陽性）的初生長時間之間的差異有統(tǒng)計學意義（Z＝-4．81，P＜0．001）。5種不同離心條件下初生長時間差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝118．73，P＜0．001）。其余4種離心條件下的初生長時間與簡單法的比較結(jié)果如表2所示。

表1 標本不同處理方法處理后的羅氏培養(yǎng)結(jié)果

表2 標本不同處理方法處理后的結(jié)核分枝桿菌初生長時間

討 論

結(jié)核分枝桿菌的病原學檢查是結(jié)核病臨床診斷的最重要的依據(jù)［6］。目前我國結(jié)核病診斷實驗室仍以痰涂片顯微鏡檢查和分枝桿菌羅氏培養(yǎng)最為常用。痰涂片顯微鏡檢查雖簡單、快速，但敏感度較低，痰涂片檢查陽性只能說明痰中含有抗酸桿菌，不能區(qū)分死菌與活菌。結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)相對于涂片顯微鏡檢查具有較高敏感度，目前仍然作為結(jié)核病診斷的金標準，并且結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)還是后續(xù)開展的藥物敏感度試驗、分枝桿菌菌種鑒定、基因分型，以及各種基礎(chǔ)研究的前提。培養(yǎng)的優(yōu)勢還體現(xiàn)在，能夠針對各種臨床標本進行檢測，包括痰液、胸、腹腔積液、腦脊液、尿液和膿液等?；谝陨显?，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù)在未來仍將作為一項重要的診斷技術(shù)，所以，對這項傳統(tǒng)技術(shù)的全面評價，并著力于提高技術(shù)的診斷效率，仍然有很大的現(xiàn)實意義。

羅氏培養(yǎng)中離心法是先對臨床標本進行相應(yīng)的離心等技術(shù)處理，以便對其中的細菌進行沉淀濃縮，從理論上講可提高標本培養(yǎng)的陽性率。den Hertog等［7］發(fā)現(xiàn)不恰當?shù)碾x心（轉(zhuǎn)速過低或是時間過短）均會導致培養(yǎng)陽性率的降低，同時認為離心的最低條件為3200×g離心22min，但該實驗缺少臨床標本的數(shù)據(jù)支持。本研究首次就臨床標本在不同離心條件對離心法培養(yǎng)的影響進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同離心條件下結(jié)核分枝桿菌的初生長時間的差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝118．73，P＜0．001），離心力或離心時間降低均會導致初生長時間延長。但不同離心條件下，陽性率有明顯差別，3000×g離心15min、3000×g離心8min、3000×g離心25min、2000×g離心15min、5000×g離心15min，5種不同離心條件下培養(yǎng) 陽 性 率 分 別 為 96．03%、89．68%、95．24%、92．06%、96．03%。由此可知當離心力或是離心時間降低均對陽性率有影響。

離心法3000×g離心15min和簡單法在初生長時間的差異有統(tǒng)計學意義（Z＝-4．81，P＜0．001），且簡單法的平均生長時間比離心法要短2d。簡單法總體污染率為3．03%（6／198），離心法3000×g離心15min的污染率為3．54%（7／198）。

綜上所述，羅氏培養(yǎng)過程中，簡單法檢出陽性率與離心法接近，但簡單法操作相對簡單、污染率較低，初生長時間也相對較短，因而可能更符合臨床的需要；應(yīng)用離心法進行羅氏培養(yǎng)時，無論是離心力或是離心時間的變化對培養(yǎng)的陽性檢出率均有影響。

［1］World Health Organization． Global tuberculosis control，WHO report 2002．Geneva：World Health Organization，2002．

［2］Sudre P，ten Dam G，Kochi A．Tuberculosis：aglobal overview of the situation today．Bull World Health Organ，1992，70（2）：149-159．

［3］Frieden TR，Sterling TR，Munsiff SS，et al．Tuberculosis．Lancet，2003，362（9387）：887-899．

［4］Sreeramareddy CT，Panduru KV，Menten J，et al．Time delays in diagnosis of pulmonary tuberculosis：a systematic review of literature．BMC Infect Dis，2009，9：91．

［5］World Health Organization．Laboratory services in tuberculosis control．Part III：Culture．Geneva：World Health Organization，1998．

［6］馬玙，朱莉貞，潘毓萱．結(jié)核病．北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：104-109．

［7］den Hertog AL，Klatser PR，Anthony RM．Buoyant density of Mycobacterium tuberculosis：implications for sputum processing．Int J Tuberc Lung Dis，2009，13（4）：466-471．