孕激素受體與T N F-α、I L-1 β、N F-κB在自然流產(chǎn)蛻膜組織中的表達(dá)及臨床意義

劉常秀，梁金好，周筱燕（.廣東省佛山市禪城區(qū)瀾石醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 佛山 58000；.廣東省南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣東 廣州 5080）

自然流產(chǎn)（SpOntaneous abortion）是指妊娠28周以前、胎兒體重＜1000 g的自然丟失，是妊娠最常見的并發(fā)癥之一，對人類的生殖有著重大的威脅。而至今約有50%左右的自然流產(chǎn)病因未明，稱之為不明原因性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（Unexplained recurrent SpOntaneous abortion，URSA），常表現(xiàn)為無任何癥狀出現(xiàn)時胚胎已停止發(fā)育[1]。目前，甾體類激素受體與炎性細(xì)胞因子在不明原因自然流產(chǎn)的發(fā)生中充當(dāng)何種角色越來越受到研究者的關(guān)注。孕激素對于排卵、受精乃至整個妊娠的維持均起著非常重要的作用，然而，其功能的形使主要是靠孕激素受體（Progesterone receptor，PR）來實(shí)現(xiàn)的[2]。研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)自然流產(chǎn)患者的雌二醇和孕酮水平以及兩者間的比率、雌激素受體（ER）水平與無自然流產(chǎn)史人群無明顯差別，但其孕激素受體（PR）水平較無自然流產(chǎn)史人群明顯減低[3]；又有研究顯示，炎性反應(yīng)細(xì)胞因子（如IL-1β）增強(qiáng)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性時可明顯抑制羊膜上皮細(xì)胞中PR的轉(zhuǎn)錄活性[4]。由此提示PR的減少可能是導(dǎo)致不明原因自然流產(chǎn)的原因，可能與炎性細(xì)胞因子的參與有關(guān)。因此，本研究檢測了自然流產(chǎn)蛻膜組織中PR與TNF-α、IL-1β、NF-κB的表達(dá)并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本研究經(jīng)廣東省佛山市禪城區(qū)瀾石醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后開展實(shí)施。收集2011年4月～2012年10月就診于我院婦產(chǎn)科門診及住院部的不明原因自然流產(chǎn)患者33例（研究組），年齡18～37歲，平均（26.7±7.3）歲，停經(jīng)時間44～79 d，平均（57.2±8.5）d。所有患者均符合以下條件：①妊娠12周以內(nèi)，有下腹痛伴陰道流血，B超顯示胚胎停止發(fā)育；②患者無保胎藥物治療和其他服藥史（如黃體酮保胎治療），無感染史及其他內(nèi)科疾病，排除抗磷脂抗體陽性和染色體異常。選擇同期就診我院門診自愿要求人工流產(chǎn)的婦女33例設(shè)為對照組，年齡20～42歲，平均（28.6±6.5）歲，停經(jīng)時間45～66 d，平均（54.9±5.2）d。且所有婦女均符合以下條件：①妊娠期無先兆流產(chǎn)癥狀和體征。②B超顯示胚胎發(fā)育正常。③無自然流產(chǎn)和死胎史，無其他內(nèi)科疾病，無感染史及其他服藥史。

1.2 主要試劑盒：Total RNA Kit（Omega公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Reverse transcription system）（Promega公司）；RT reagent kit、SYBR Premix Ex TaqTM反應(yīng)體系（TaKaRa公司）。

1.3 標(biāo)本采集：在獲取入選對象知情同意并詳細(xì)記錄其人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征及相關(guān)臨床資料。采用吸刮的方式獲取蛻膜組織，用無菌生理鹽水沖洗后以無酶管分裝，保存于－80℃冰箱或液氮中備用。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測蛻膜組織PR、NF-κB、TNF-α和IL-1βmRNA的表達(dá)：取50～100 mg凍存組織放入碾缽碾碎，加入適量Trizol（1 ml/100 mg）并不斷研磨，在此過程中可不斷補(bǔ)充液氮。嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。各擴(kuò)增基因引物如下：

與內(nèi)參基因β-actin標(biāo)化，以2-ΔΔCT值表示目的基因相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS 13.0對各項(xiàng)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，各項(xiàng)參數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t和χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛻膜組織PR mRNA表達(dá)：采用qRT-PCR我們檢測了蛻膜組織PR的表達(dá)情況。與正常人工流產(chǎn)蛻膜組織比較，不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織PR mRNA表達(dá)明顯降低（P=0.011）。詳見圖1。

2.2 蛻膜組織NF-κB、TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)：檢測蛻膜組織中部分炎性反應(yīng)因子的表達(dá)情況。詳見圖2。與正常人工流產(chǎn)蛻膜組織比較，不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織NF-κB、TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.001，P=0.008，P=0.009）。

圖1 不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織PR mRNA表達(dá)：A：正常人工流產(chǎn)蛻膜組織，B：不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織

圖2 不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織NF-κB、TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)：A：正常人工流產(chǎn)蛻膜組織，B：不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織

2.3 蛻膜組織PR表達(dá)與NF-κB表達(dá)的相關(guān)性分析：相關(guān)性分析顯示，不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織中PR表達(dá)與NF-κB表達(dá)明顯負(fù)相關(guān)（r=－0.508，P＜0.013），詳見圖3。

2.4 蛻膜組織TNF-α、IL-1β表達(dá)與NF-κB表達(dá)間的關(guān)性分析：詳見圖4。不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織中TNF-α、IL-1β的表達(dá)均與NF-κB的表達(dá)顯著呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.680，P＜0.001，r=0.670，P＜0.001。

3 討論

孕激素在孕卵著床過程中必不可少，其生物作用的發(fā)揮也必需依賴于受體，即孕激素受體（Progesterone receptor，PR）。PR具有專一性，缺少PR的組織，不能對孕激素產(chǎn)生任何生物效應(yīng)，并且孕激素對組織產(chǎn)生作用的強(qiáng)度，與組織中PR的量以及PR被消耗后細(xì)胞對其再生的能力有關(guān)。當(dāng)組織細(xì)胞中PR濃度升高時，細(xì)胞對孕酮的生理反應(yīng)也隨之遞增，并為孕卵的著床奠定良好的基礎(chǔ)[5]。阻斷孕激素與其受體的結(jié)合可以終止妊娠反應(yīng)，如目前較常用的米非司酮藥物流產(chǎn)就是利用米非司酮結(jié)合蛻膜組織中的孕酮受體，阻斷孕激素的作用，使蛻膜組織變性壞死從而終止早孕。大量研究顯示，PR在正常早孕組蛻膜中有較高水平的表達(dá)，而在自然流產(chǎn)蛻膜組織中表達(dá)明顯減少[6-7]。由此說明適量的PR水平對維持正常妊娠有著重要的作用，PR的減少可能是導(dǎo)致不明原因自然流產(chǎn)的主要原因之一。在本研究中，發(fā)現(xiàn)不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織PR mRNA表達(dá)明顯低于正常人工流產(chǎn)組蛻膜組織中的表達(dá)（P＜0.05），結(jié)果提示PR數(shù)量減少是引起不明原因自然流產(chǎn)的重要因素，值得深入研究。

圖3 不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織PR表達(dá)與NF-κB表達(dá)的相關(guān)性

NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與啟動與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)機(jī)體炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)。近來研究顯示NF-κB與生殖活動密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)胚胎的著床和發(fā)育等生理和病理過程，其活性的降低對妊娠的成功維持極為重要。正常妊娠早期子的宮內(nèi)膜和蛻膜組織中NF-κB的表達(dá)呈下調(diào)趨勢，減少免疫抑制，以便妊娠的維持；同時，末梢循環(huán)T淋巴細(xì)胞中的NF-κB在妊娠婦女的表達(dá)明顯低于非孕婦女[8]。呂麗賢等發(fā)現(xiàn)，早期妊娠流產(chǎn)患者滋養(yǎng)細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)明顯高于正常妊娠行人工流產(chǎn)患者，這也提示NF-κB的表達(dá)增強(qiáng)和活化可能參與了早期流產(chǎn)發(fā)病的機(jī)制之一[9]。研究表明TNF-α和IL-1β與胚胎的發(fā)育也密切相關(guān)[10]。女性生殖道、胎盤組織、胚胎以及黃體細(xì)胞、閉鎖卵泡等內(nèi)廣泛存在TNF-α基因的表達(dá)[11]。妊娠時適量的TNF-α有利于細(xì)胞代謝及胚胎的發(fā)育，促進(jìn)絨毛膜促性腺激素和孕激素的合成，從而有助于降解蛻膜細(xì)胞外的基質(zhì)和胎盤植入[12]。而當(dāng)母體免疫功能異常或某些因素激活巨噬細(xì)胞、中心粒細(xì)胞等白細(xì)胞時，導(dǎo)致TNF-α水平異常升高，可影響胚胎的發(fā)育。有反復(fù)自然流產(chǎn)史的早期妊娠婦女血清TNF-α水平顯著高于正常早孕婦女，在母胎界面組織中存在某些因素促進(jìn)TNF-α分泌增多，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致絨毛生長抑制，蛻膜壞死，進(jìn)而阻礙孕卵的發(fā)育[13-14]。同樣，IL-1β可能參與了胚胎的發(fā)育與著床、蛻膜化、分娩等多個生殖環(huán)節(jié)[15]。如IL-1β可通過調(diào)節(jié)孕婦組織中絨毛膜促性腺激素、前列腺素E2、胎盤催乳素等物質(zhì)的活性，阻止宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過度，促進(jìn)胚胎植入及生長發(fā)育[16]。排除外來炎性反應(yīng)干擾時，異常增多的IL-1β可與其他細(xì)胞因子協(xié)同促進(jìn)孕婦前列腺素E2的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞毒性和炎性反應(yīng)，影響胚胎發(fā)育[17]。在本研究中，NF-κB、TNF-α和IL-1β在不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織中的表達(dá)較正常人工流產(chǎn)組顯著增強(qiáng)（P＜0.05），提示NF-κB、TNF-α和IL-1β的異常表達(dá)參與了自然流產(chǎn)。

研究顯示TNF-α和IL-1β可明顯增強(qiáng)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，而NF-κB的活化又可增強(qiáng)TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平，使TNF-α和IL-1β產(chǎn)生增加，進(jìn)一步活化NF-κB，產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)[18]。又有研究顯示，過表達(dá)PR可以顯著抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，而IL-1β在增強(qiáng)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的同時卻可抑制PR的轉(zhuǎn)錄活性[19]，抑制局部炎性反應(yīng)[20]；PR-A和PR-B完全敲除的乳腺癌T47D細(xì)胞NF-κB p65如核顯著增多[21]；采用IL-1β缺陷妊娠小鼠研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β對NF-κB的調(diào)節(jié)在胚胎植入和發(fā)育過程中起了重要作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，不明原因自然流產(chǎn)蛻膜細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的表達(dá)均與NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)，而NF-κB的表達(dá)與PR的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這提示NF-κB與TNF-α、IL-1β相互作用，使炎性反應(yīng)級聯(lián)放大，不利于胚胎的發(fā)育；與此同時，表達(dá)增強(qiáng)和活化的NF-κB可能通過某種機(jī)制使PR生成減少，消弱孕激素的作用，引起子宮蛻膜發(fā)育不良，最終導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。

圖4 不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織TNF-α、IL-1β表達(dá)與NF-κB表達(dá)間的關(guān)性

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織中NF-κB、TNF-α和IL-1β大量表達(dá)，NF-κB的活性增強(qiáng)，但PR表達(dá)明顯減少，TNF-α、IL-1β的表達(dá)均與NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)，而NF-κB的表達(dá)與PR的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。其結(jié)果提示，PR的減少可能是導(dǎo)致不明原因自然流產(chǎn)的原因，可能與NF-κB的激活啟動炎性反應(yīng)有關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究，可為不明原因自然流產(chǎn)的治療開辟新途徑。

[1] Zhang BY,Wei YS,Niu JM,et al.Risk factors for unexplained recurrent SpOntaneous abortion in a population from southern China[J].International Journal of Gynecology &Obstetrics,2010,108(2):135.

[2] Aruna M,Nagaraja T,Andal S,et al.Role of Progesterone Receptor Polymorphisms in the Recurrent SpOntaneous Abortions:Indian Case[J].PLoS ONE,2010,5(1):12.

[3] Carranza L,Blanquet J,Tserotas K,et al.Endometrial progesterone and estradiol receptors in patients with recurrent early pregnancy loss of unknown etiology-preliminary report[J].Med Sci Monit,2000,6(4):759.

[4] Allport VC,Pieber D,Slater DM,et al.Human labour is associated with nuclear factor-kB activity which mediates cyclo-oxygenase-2 expression and is involved with the functional progesterone withdrawal[J].Mol Hum Reprod,2001,22(3):581.

[5] Christian GA,Porfirio GA,Marcos GJ,et al.Role of progesterone receptor isoforms in female sexual behavior induced by progestins in rats[J].Neuroendocrinology,2009,90(1):73.

[6] Traina E,Daher S,Franchim CS,et al.Progesterone receptor gene polymorphism and recurrent SpOntaneous abortion[J].Rev Bras Ginecol Obstet,2010,32(5):229.

[7] Su MT,Lee IW,Chen YC,et al.Association of progesterone receptor polymorphism with idiopathic recurrent pregnancy loss in Taiwanese Han population[J].J Assist Reprod Genet,2011,28(3):239.

[8] Reznikov LL,Shames BD,Barton HA,et al.Interleukin-1β deficiency results in reduced NF-κB levels in pregnant mice[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2000,278(1):263.

[9] 呂麗賢.核因子-κB在早期流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達(dá)[J].醫(yī)學(xué)動物防制,2007,23(3):476.

[10] Nicolaos V,Constantinos P,Emmanuel E,et al.Elevated circulating IL-1β and TNF-Alpha,and unaltered IL-6 in first-Trimester pregnancies complicated by threatened abortion with an adverse outcome[J].Mediators In fl amm,2006,26(2):304.

[11] Monzon BF,Vadillo OF,Feinberg RF.Modulation of trophoblast function by tumor necrosis factor-alpha:a role in pregnancy establishment and maintenance[J].Am J Obstet Gynecol,2002,18(7):1574.

[12] Ryden M,Arner P.Tumour necrosis factor-alpha in human adipose tissue from signalling mechanisms to clinical implications[J].J Intern Med,2007,26(2):431.

[13] Amrit K,Anupam K.Recurrent pregnancy loss:TNF-α and IL-10 polymorphisms[J].J Hum Reprod Sci,2011,4(2):91.

[14] Liu CM,Wang J,Zhou SU,et al.Association between 238 but not 308 polymorphism of Tumor necrosis factor alpha(TNF-alpha)and unexplained recurrent SpOntaneous abortion(URSA) in Chinese population[J].Reprod Biol Endocrinol,2010,28(1):114.

[15] Traina E,Daher S,Moron AF.Polymorphisms in VEGF,progesterone receptor and IL-1 receptor genes in women with recurrent SpOntaneous abortion[J].J Reprod Immunol,2011,88(1):53.[16] Gao X,Belmadani S,Picchi A,et al.Tumor necrosis factoralpha induces endothelial dysfunction in Leprdb mice[J].Circulation,2007,115(2):245.

[17] Tsukihara S,Harada T,Deura I,et al.Interleukin-l beta-induced expression of IL-6 and cells via production of human nuclear factorkappa chorionic gonadotropin in human trophoblast B activation[J].Am J Reprod Immunol,2004,52(3):218.

[18] Koike T,Nadeen QM,Tsuchida M,et al.Pretreatment with olprinone hydrochloride,a phosphodiesterase Ⅲ inhibitor,attenuates lipopolysaccharide-induced lung injury via an anti-inflammatory effect[J].Pulm Pharmacol Ther,2008,21(1):166.

[19] Lappas M,Yee K,Permezel M,et al.Lipopolysaccharide and TNF-alpha activate the nuclear factor kappa B pathway in the human placental JEG-3 cells[J].Placenta,2006,27(6):568.

[20] Tan H,Yi L,Rote NS,et al.Progesterone receptor-A and -B have opposite effects on proinflammatory gene expression in human myometrial cells:implications for progesterone actions in human pregnancy and parturition[J].J Clin Endocrinol Metab,2012,97(5):719.

[21] Hardy DB,Janowski BA,Corey DR.Progesterone receptor plays a major antiinflammatory role in human myometrial cells by antagonism of nuelear faetor-kappκB activation of cyelooxygenase-2 expression[J].Mol Endoerinol,2006,20(11):2724.

[22] Reznikov LL,Shames BD,Barton HA,et al.Interleukin-lbeta deficiency results in reduced NF-kappa B levels in pregnant mice[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2000,278(1):263.