探討標(biāo)本與固相抗體反應(yīng)時(shí)間對ELISA法檢測HBsAg結(jié)果的影響

曹青梅，喬飛飛（延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 延安 716000）

乙型肝炎病毒（HBV）是嚴(yán)重危害人類健康的病毒之一。HBV可誘發(fā)一系列肝臟疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給其家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。乙型肝炎表面抗原（HBsAg）是臨床實(shí)驗(yàn)室最為常用的檢驗(yàn)項(xiàng)目之一，常作為乙型肝炎的感染指標(biāo)之一。衛(wèi)生部要求從2010年10月1日起執(zhí)行《中華人民共和國藥典（2010版）》后，HBsAg的測定由原來的ELISA一步法（一步法）改成了ELISA二步法（二步法），即將待測標(biāo)本與固相抗體反應(yīng)的時(shí)間由原來的0min改為60min，使實(shí)驗(yàn)室的操作步驟增多，同時(shí)延長了反應(yīng)時(shí)間。部分實(shí)驗(yàn)室為了操作簡便，仍沿用一步法，現(xiàn)就待測標(biāo)本與固相抗體反應(yīng)不同放置時(shí)間對試驗(yàn)結(jié)果的影響報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料:標(biāo)本來自2012年1月～2012年4月，延安大學(xué)附屬醫(yī)院感染病科住院患者。所需標(biāo)本均空腹抽血3 ml，離心分離血清，用時(shí)間分辨熒光法（TRFIA）定量檢測乙型肝炎表面抗原。選取HBsAg濃度＞30ng/ml的血清標(biāo)本100例，HBsAg濃度為0.5～30ng/ml（不包括0.5ng/ml）的血清標(biāo)本50例，將這些標(biāo)本分裝后置于－20℃冰箱保存，以備統(tǒng)一檢測。保存過程中不可以反復(fù)凍融。所選取標(biāo)本均無溶血、黃疸。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑:時(shí)間分辨熒光法（TRFIA）試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法試劑由廈門英科新創(chuàng)科技有限公司提供。

1.2.2 儀器:測定儀器為美國Perkin Elmer公司生產(chǎn)的1235時(shí)間分辨熒光檢測儀；上?？迫A實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的KHB ST360的酶標(biāo)儀。

1.3 測定方法:取出試劑盒（包括反應(yīng)板、酶標(biāo)抗體、顯色劑），平衡至室溫，將所收集標(biāo)本自然溶解平衡至室溫，用ELISA法做第一步（待測標(biāo)本與固相抗體的反應(yīng)）放置60min、30min、0min的對比試驗(yàn)，具體步驟如下:①編號后96個(gè)孔均加20μl樣品稀釋液，并在一二孔分別加陽性對照，陰性對照，第三孔為空白對照，其余93個(gè)孔加待測血清100μl，置37℃溫育0min、30min、60min；②在每孔加酶標(biāo)記抗體50μl，置37℃溫育30min，洗板5次并拍干；③每孔加底物A、B各50μl，混勻置37℃溫育30min；④每孔加終止液50μl，混勻，用酶標(biāo)儀測定各孔OD值，再經(jīng)過陰性對照對比。臨界值=陰性對照孔OD平均值×2.1（陰性對照OD均值小于0.05時(shí)以0.05計(jì)算），樣本OD值S/C.O.≥1者為陽性，反之為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用陽性率來描述，陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組間的多重比較用χ2分割檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組對比試驗(yàn)結(jié)果:見表1。

表1 三組對比試驗(yàn)結(jié)果（例）

2.2 三組對比試驗(yàn)陽性率的比較:三組對比試驗(yàn)的陽性率均較高，但總體率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表2。為了進(jìn)一步的分析兩兩之間的差異，再采用χ2分割，詳見表3，放置0min與30min差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），放置0min與60min差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），放置30min與60min差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 三組對比試驗(yàn)陽性率的比較（例）

表3 三組對比試驗(yàn)兩兩比較（例）

3 討論

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的一種我國高發(fā)的傳染病。乙型肝炎表面抗原（HBsAg）存在于HBV的外殼部分，是乙肝患者血清中首先出現(xiàn)的病毒標(biāo)志物。可用于乙肝的早期診斷和普查，在急性肝炎潛伏期即可出現(xiàn)陽性[2]。HBsAg是臨床上常見的檢測項(xiàng)目，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測HBsAg是目前臨床實(shí)驗(yàn)室最普遍、最經(jīng)濟(jì)的方法，它具有快速、簡便、靈敏度高、特異性好和成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于中小型醫(yī)院[3]。

ELISA-夾心法是待測成分與包被于固相上的包被物發(fā)生反應(yīng)后，再與酶標(biāo)記成分反應(yīng)，形成目的復(fù)合物:包被物—待測物—標(biāo)記物[4]。待測標(biāo)本的血清加入反應(yīng)板后，待測物就開始與包被物（固相抗體）發(fā)生反應(yīng)，故待測標(biāo)本與固相抗體的反應(yīng)時(shí)間越長，反應(yīng)就越充分，加酶標(biāo)抗體后形成的夾心復(fù)合物也就越多。一步法是將待測標(biāo)本與酶標(biāo)記抗體同時(shí)加入包被板，而二步法則將待測標(biāo)本加入包被板溫育60min后再加酶標(biāo)記抗體。由于二步法的操作步驟較多，反應(yīng)時(shí)間也較長，部分實(shí)驗(yàn)室在ELISA法由原來的一步法改成了兩步法后仍沿用一步法，致使對檢測結(jié)果尤其是弱反應(yīng)性結(jié)果造成了一定的影響。已有資料表明，在我國的乙型肝炎病毒（HBV）感染人群中，有一部分血清HBV表面抗原（HBsAg）呈低水平狀態(tài)存在，且部分感染者存在病毒復(fù)制，因此忽略弱反應(yīng)性結(jié)果，尤其是陽性判斷值以下的結(jié)果將造成人群的漏檢[5-6]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，HBsAg濃度大于30ng/ml的血清標(biāo)本，用一步法、二步法及將待測標(biāo)本與固相抗體反應(yīng)時(shí)間設(shè)為30min，他們的結(jié)果相符，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而對于HBsAg濃度為0.5～30ng/ml的血清標(biāo)本，當(dāng)待測標(biāo)本與固相抗體的反應(yīng)時(shí)間為0min時(shí)，其結(jié)果與將反應(yīng)時(shí)間設(shè)為30min和60min差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且與定量結(jié)果也不相符。因此，只有保證待測標(biāo)本與固相抗體反應(yīng)的時(shí)間至少為30min，其結(jié)果才可以與定量檢測的結(jié)果相符。

近幾年來，臨床上乙型肝炎表面抗原呈現(xiàn)弱反應(yīng)性的標(biāo)本越來越多，目前對這種弱陽性反應(yīng)沒有一個(gè)統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)，因此對檢驗(yàn)工作造成了困擾，并可能引起醫(yī)療糾紛。HBsAg弱反應(yīng)性的形成原因主要在于[2]:①HBsAg滴度低，常規(guī)方法不能檢出；②HBsAg隱匿在HBsAg/抗-HBs復(fù)合物中；③病毒整合后基因替代突變?nèi)笔Щ蛑嘏?；④HBV變異株產(chǎn)生HBsAg缺陷，抗原免疫源性改變；⑤干擾因素:內(nèi)源性干擾因素如類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、治療性抗體、溶菌酶等，外源性干擾因素如溶血、細(xì)菌污染、凝固不全等。這些標(biāo)本的檢測結(jié)果可能為陰性或處在灰區(qū)，但具有傳染性，對乙型肝炎的預(yù)防及控制埋下了隱患，同時(shí)也可能導(dǎo)致輸血相關(guān)乙型肝炎的傳播[7]。因此，對低水平存在的血清HBsAg進(jìn)行有效檢測，具有重要的臨床及流行病學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)室人員通過縮短待測標(biāo)本與固相抗體的反應(yīng)時(shí)間而簡化實(shí)驗(yàn)室操作，雖然縮短了等待時(shí)間，但對于低濃度的標(biāo)本，待測標(biāo)本與固相抗體反應(yīng)時(shí)間過短，極易引起漏檢，從而對臨床醫(yī)生為患者的疾病診治帶來了不便。為此，在檢測的過程中，待測標(biāo)本與固相抗體的反應(yīng)時(shí)間最少為30min以上。

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